色谱  2014, Vol. 32 Issue (9): 992-998   PDF (1693 KB)    
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郑立洋
陈娟娟
徐继林
周成旭
严小军
高效液相色谱-三重四极杆质谱同时测定与筛查海洋浮游藻类中的5种色素
郑立洋, 陈娟娟 , 徐继林, 周成旭, 严小军    
宁波大学海洋学院, 浙江 宁波 315211
收稿日期：2014-6-12
基金项目：国家自然科学基金项目（31172448）；宁波市科技攻关项目（2013C10014）；浙江海洋技术创新团队项目（2010R50029，2012R10029）；宁波市海洋藻类技术创新团队项目（2011B81007）.
通讯作者：陈娟娟，E-mail: chenjuanjuan@nbu.edu.cn.
摘要：对海洋藻类色素的高效液相色谱-三重四极杆质谱（HPLC-QqQ-MS）分析方法的有效性进行了验证。该方法采用C16氨基色谱柱为固定相，以甲醇、乙腈和乙酸铵为流动相，在选择反应监测模式下对叶绿素a、叶绿素b、 β，β -胡萝卜素、叶黄素和岩藻黄素的含量进行了测定。结果表明，5种色素标准品的线性关系良好，相关系数（r2）均高于0.996，回收率在82.77%~99.83%之间，日内和日间精密度的相对标准偏差（RSD）均小于5%（n=5）；方法的检出限（LOD）在0.02~0.16 μg/L之间，定量限（LOQ）在0.06~0.54 μg/L之间。利用该方法对11种藻类中5种色素的含量进行分析，比较了赤潮异弯藻、卡罗藻、微小原甲藻、微拟球藻、蛋白核小球藻、颗石藻、定鞭金藻、中肋骨条藻、威氏海链藻和假微型海链藻之间的物种色素分布情况。该方法具有简单、灵敏度高、重复性好、回收率高等优点，适合藻类色素分析，为进行藻类生物量计算提供了分析手段。
关键词： 高效液相色谱-三重四极杆质谱     色素     海洋浮游藻类    
Simultaneous determination and screening of five pigments in marine phytoplanktons by high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry
ZHENG Liyang, CHEN Juanjuan , XU Jilin, ZHOU Chengxu, YAN Xiaojun    
School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China
Received: 2014-6-12
Abstract: A quantitative method based on high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem triple-quadrupole mass spectrometry (HPLC-ESI-QqQ-MS) has been established for five pigments in marine phytoplanktons. The HPLC method used ternary solvent systems and a reversed-phase C16-amide column. In addition, methanol, acetonitrile and aqueous ammonium acetate were used as mobile phases. Five pigments (chlorophyll a, chlorophyll b, β, β -carotene, lutein and fucoxanthin) were quantified in selective reaction mode. As results, good linear relationships were achieved between the concentrations and the peak areas of the five pigment standards. And their correlation coefficients (r2) were higher than 0.996. The recoveries of the pigment standards were between 82.77% and 99.83%. The inter-day and intra-day precisions were lower than 5% (n=5). The detection limits of the pigments for this method were between 0.02 and 0.16 μg/L and the quantification limits were in the range from 0.06 to 0.54 μg/L. According to the above method, eleven algae (Heterosigma akashiwo (NMBRah03-2), Heterosigma akashiwo (NMBRah03-2-2), Karlodinium veneficum (NMBjah047-1), Prorocentrum minimum (NMBjah042), Nannochloropsis oceanic (NMBluh014), Chlorella pyrenoidosa (NMBluh015-1), Pleurochrysis sp. (NMBjih026-1), Prymnesium sp. (NMBjih029), Skeletonema costatum (NMBguh004-1), Thalassiosira weissflogii (NMBguh021) and Thalassiosira pseudonana) (NMBguh005)) have been investigated for comparing the pigment distributions. The method is sensitive, accurate, reproducible, and useful for the study of alga compositions.
Key words: high performance liquid chromatography-triple-quadrupole mass spectrometry (HPLC-QqQ-MS)     pigments     marine phytoplanktons    

海洋浮游藻类是海洋的初级生产者,在物质循环与能量转换、海洋食物网结构的基础环节,在海洋生态系统的过程中起到至关重要的作用[1]。浮游藻类色素已被证实为浮游植物分类的重要化学分类标志物[2],并被应用于传统显微镜镜检难以确定的微型浮游藻和由于过滤损失或预处理易被破坏的微藻种类鉴别中[3]。浮游藻类色素主要分为3类:叶绿素、类胡萝卜素和藻胆蛋白,其中叶绿素a普遍存在于所有藻类细胞中并被广泛用作测定生物量的标志物,叶绿素b和叶黄素被认为是绿藻的特征色素,β ,β -胡萝卜素广泛存在于海洋浮游藻类中,岩藻黄素被认为是硅藻的特征色素[4, 5];这5种色素对海洋藻类生物量研究具有重要意义。

如今,采用高效液相色谱(HPLC)分析色素的方法已广泛应用于调查研究海洋藻类组成和浮游藻类群生物量,一次运行可分离超过50种色素且具有较好的分离度,实现了自动快速对样品进行定性定量分析[6]。HPLC分析浮游藻类色素的方法已被应用于确定浮游藻种类、评估自然水体中浮游藻生物量和生物多样性等[7]。现已发展多种用于HPLC分离的色谱柱:C8色谱柱[8, 9]、C18色谱柱[10, 11, 12]、C30色谱柱[13]和C16氨基色谱柱[6]。C18色谱柱对极性叶绿素和二乙烯基叶绿素的分离效果不好,C30色谱柱常被用于食品色素分析而在浮游藻类色素分析上有局限性[13]。2011年,Jayaraman等[6]首次使用反相C16氨基色谱柱。C16氨基色谱柱最初是为药物制备纯化和分析而设计,以其酰胺官能团特有的性质使得C16氨基色谱柱在承受高比例含水流动相、分离物质极性范围、洗脱能力等方面优于C8色谱柱和C18色谱柱。自然界中色素种类繁多、化学结构相似、极性差别大等给HPLC分离带来了难度。HPLC-MS技术可以为这类结构类似物提供更多、更有价值的色谱与电子光谱数据[14];该技术可以通过色素质荷比的不同和特征离子的差异进行分离和判定目标物质[15]。HPLC-MS技术越来越广泛地应用于海洋光合色素分析中。其中,高效液相色谱-三重四极杆质谱联用(HPLC-QqQ-MS)系统以其定量精确性成为色素分析的新手段[16]。

色素中存在大量的同分异构体,比如原脱植基叶绿素与甲基脱植基叶绿素,海胆酮、隐藻黄素与蓝藻黄素,角黄素与别藻黄素,β ,β -胡萝卜素、 β ,ε -胡萝卜素、 ε ,ε -胡萝卜素与 β ,ψ -胡萝卜素等。LC-MS定量分析过程中,由于色谱分离原因,一个色谱峰中可能含有几种不同的组分,即保留时间相同、相对分子质量也相同的同分异构体,使得这类物质的精确定量受到影响。为了消除干扰,串联质谱的选择反应监测(SRM)模式是最佳选择,SRM模式以组分相对应的特征碎片离子作为定量离子,有效消除了干扰组分的影响,从而使得定量更加精确。

本文利用HPLC-QqQ-MS的SRM模式建立了5种色素叶绿素a、叶绿素b、 β ,β -胡萝卜素、叶黄素和岩藻黄素的定量分析方法,并利用该方法比较了赤潮异弯藻、卡罗藻、微小原甲藻、微拟球藻、蛋白核小球藻、颗石藻、定鞭金藻、中肋骨条藻、威氏海链藻和假微型海链藻之间物种色素的分布情况。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

TSQ Quantum Access液相色谱-三重四极杆质谱联用系统(美国ThermoFisher Scientific公司),超纯水系统(法国Millipore公司)。叶绿素a(纯度＞95% )、叶绿素b(纯度＞90% )、 β ,β -胡萝卜素(纯度＞95% )、叶黄素(纯度＞75% )、岩藻黄素(纯度＞95% )、甲醇和乙腈(HPLC级,美国Sigma-Aldrich公司),丙酮(HPLC级,国药集团化学试剂有限公司),乙酸铵(HPLC级,美国TEDIA公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 标准溶液的配制

准确称取叶绿素a、叶绿素b、 β ,β -胡萝卜素、叶黄素和岩藻黄素各1.0 mg,分别用丙酮、90%(v/v)丙酮水溶液、氯仿、丙酮和乙醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中,均配制成0.1 g/L 的单标准储备液,置于-80 ℃冰箱中保存。制作工作曲线时,用甲醇将储备液稀释成不同浓度的标准溶液。

1.3 藻种培养和收获

藻种由浙江省海洋生物工程重点实验室微藻种质库提供,分离自浙江沿海和胶州湾。选用藻种有甲藻、绿藻、针胞藻、定鞭藻和硅藻。甲藻:卡罗藻(Karlodinium veneficum)(NMBjah047-1)和微小原甲藻(Prorocentrum minimum)(NMBjah042);绿藻:微拟球藻(Nannochloropsis oceanic)(NMBluh014)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)(NMBluh015-1);针胞藻:赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)(NMBRah03-2)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)(NMBRah03-2-2);定鞭藻:颗石藻(Pleurochrysis sp.)(NMBjih026-1)和定鞭金藻(Prymnesium sp.)(NMBjih029);硅藻:中肋骨条藻(Skeletonema costatum)(NMBguh004-1)、威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)(NMBguh021)和假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)(NMBguh005)。藻种培养在F/2培养基中,置于光暗周期比为12 h ∶ 12 h的光照培养箱内,光照强度范围为40～70 μ mol quanta/(m2·s),生长温度为20 ℃。藻种在指数生长期末尾收获约100 mL藻种培养液,在弱真空(＜0.03 MPa)和微光下过滤到0.22 μ m Whatman GF/F玻璃纤维滤膜上。滤膜用锡箔纸包裹保存在-80 ℃下冷冻保存。冷冻的滤膜需在一个月内进行色素提取和分析。

1.4 色素提取

将冷冻的滤膜快速解冻后剪碎放入10 mL具塞棕色玻璃试管中,加入2.7 mL冷丙酮后在冰水浴中超声2 min,再加入0.3 mL的超纯水,使丙酮最终含量为90% ,将超声后的玻璃试管放在-20 ℃冰箱中静置过夜提取。上机检测前先于 12000 r/min 下离心10 min,取上清液再用聚四氟乙烯(PTFE)滤膜针筒过滤器过滤，去除杂质和细胞碎片。检测时在300 μ L的检测样品中加入300 μ L 0.5 mol/L 乙酸铵溶液以提高分离度和改善峰形[6]。所有操作均在暗室中的冰盒内进行。处理后的样品必须在48 h内上机检测以降低色素降解对结果的影响。

1.5 HPLC-QqQ-MS条件

色素提取物通过TSQ Quantum Access高效液相色谱系统分离。使用Supelco Discovery C16氨基色谱柱(150 mm×4.6 mm,粒径5 μ m,孔径18 nm),进样量为10 μ L,柱温为30 ℃;流动相为甲醇(A)、乙腈(B)和0.5 mol/L 乙酸铵溶液(C),流速为1.0 mL/min,按1 ∶ 4的分流比进入离子源。线性梯度洗脱程序:0 min,80%A,20%C; 7 min,72%B,20%C; 11 min， 77%B,18%C; 19 min,85%B,2%C; 30 min,80%B,20%A; 34 min,60%B,40%A; 36 min,80%A,20%C,保持4 min;洗脱总时间为40 min。样品室温度设定为4 ℃,二极管阵列检测器(FINNIGAN SURVEYOR PDAPlus)的检测波长为350～750 nm。采用电喷雾电离源(ESI)正离子电离模式,喷雾电压2.5 kV,鞘气流量25 L/min,辅助气流量5 L/min,离子传输毛细管温度320 ℃,喷雾器温度300 ℃。扫描采用SRM模式。特征碎片离子及碰撞能量见表1。采集时间均为0.2 s,碰撞气体采用高纯氩气,碰撞气压力0.2 Pa。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽0.7 Da。

表1 5种色素标准品在HPLC-ESI-QqQ-MS SRM模式下的 特征碎片离子和碰撞能量 Table 1 Transitions monitored of the five pigments by HPLC-ESI-QqQ-MS in SRM mode
2 结果与讨论
2.1 质谱离子化条件的选择

以流动注射方式对1 ng/L 的5种色素标准溶液进行ESI-MS分析,分别在正、负离子模式下检测。对比两种模式,各目标物的正离子信号比负离子信号强度高1～3个数量级,因此选择正离子模式作为质谱采集模式。在正离子模式下离子峰的信号最强,叶绿素a、叶绿素b和岩藻黄素产生的[M+H]+分别为m/z 893.6、907.6和m/z 659.3; β ,β -胡萝卜素和叶黄素产生的[M]+分别为m/z 536.3和m/z 568.4。故选择各目标化合物的[M+H]+或[M]+作为SRM模式的母离子进行二级质谱扫描,叶绿素a的母离子在二级质谱中脱去二十碳烯链形成[M+H-C20H40]+离子峰,再脱去一个乙酸形成[M+H-C20H40-CH3COOH]+离子峰,其二级碎裂如图1a所示,主要产生碎片离子m/z 615.3和m/z 555.2。叶绿素b在二级质谱中的裂解规律与叶绿素a相同(因为两者在结构上差异小,叶绿素b的侧链上为-CHO,叶绿素a为-CH3),其二级碎裂如图1b所示,主要产生碎片离子m/z 628.8和m/z 569.3。 β ,β -胡萝卜素的母离子在二级质谱中脱去一个甲苯形成[M-C7H8]+离子峰,再脱去一个甲基形成[M-C7H8-CH3]+离子峰,其二级碎裂如图1c,主要产生碎片离子m/z 444.3和m/z 429.1。叶黄素的母离子在二级质谱中脱去一个甲苯形成[M-C7H8]+离子峰,再脱去一个 β -环形成[M-C7H8-C9H13O]+离子峰,其二级碎裂如图1d,主要产生碎片离子m/z 476.3和m/z 338.1。岩藻黄素的母离子在二级质谱中脱去一分子水形成[M+H-H2O]+离子峰,再脱去一分子水和一个乙酸形成[M+H-2H2O-CH3COOH]+离子峰,其二级碎裂如图1e，主要产生碎片离子m/z 641.1和m/z 567.1。选择上述母离子和主要碎片离子作为定量离子,以SRM正离子模式优化锥孔电压(tube lens offset)、碰撞能量(collision energy)等质谱参数。5种色素标准溶液的SRM离子流图如图2所示。

图1 5种色素的裂解原理图 Fig.1 Scheme fragments of the five pigments a. chlorophyll a; b. chlorophyll b; c. β ,β -carotene; d. lutein; e. fucoxanthin.

图2 5种色素标准溶液的SRM谱图 Fig.2 Selected reaction monitoring chromatograms of the five pigment standard solutions
2.2 方法验证
2.2.1 标准曲线、检出限(LOD)和定量限(LOQ)

用标准储备液分别精确配制含叶绿素a、叶绿素b、 β ,β -胡萝卜素和叶黄素为10、50、100、500和 1000 μ g/L,岩藻黄素为100、150、200、500和 1000 μ g/L 的混合标准溶液。采用1.5节的条件进行HPLC-MS分析。结果显示5种色素标准品在其线性范围内的相关系数r2＞0.996,其标准曲线如表2所示。

表2 5种色素标准品的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限 Table 2 Calibration equations,correlation coefficients (r2),linear ranges,LODs and LOQs of the five pigments

各取10 μ L 1 μ g/L 叶绿素a、1 μ g/L 叶绿素b、1 μ g/L β ,β -胡萝卜素、1 μ g/L 叶黄素和10 μ g/L 岩藻黄素标准溶液进行分析,测定此浓度下的信噪比(S/N)。将对应S/N=10和S/N=3的各标准溶液浓度分别作为定量限(LOQ)和检出限(LOD),结果如表2所示。方法的LOD均不高于0.16 μ g/L,LOQ在0.06～0.54 μ g/L 之间。而HPLC方法的检出限和定量限分别在1.05～12.70 μ g/L 和3.14～38.11 μ g/L 之间[17],表明本方法检测色素的灵敏度很高。

2.2.2 方法的精密度和回收率

取低、中、高3个浓度的混合标准溶液进行测定,计算方法的精密度。在一天内连续进样测定5次,记录5种色素的峰面积及保留时间,分别计算各色素的保留时间和峰面积的精密度,各色素的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)见表3。由此可见,保留时间的日内RSD为0.07% ～0.41% ,峰面积的日内RSD为0.42% ～4.20% ;连续5天每天连续进样测定5次,记录5种色素的峰面积及保留时间,分别计算各色素的保留时间和峰面积的日间精密度,各色素保留时间和峰面积的日间RSD见表3。由此可见,保留时间的日间RSD为0.04% ～0.40% ,峰面积的日间RSD为0.57% ～4.30% 。实验结果表明本方法的精密度良好。

表3 5种色素的空白加标回收率和日内、日间测定精密度 Table 3 Spiked recoveries in a blank sample and intra-day and inter-day detection precisions (RSDs) of the five pigments

通过空白添加实验方法测定方法的回收率。以空白滤膜为样品,分别添加低、中、高3个水平的标准溶液进行加标回收实验,每个加标水平平行测定3次,结果见表3。由此可见5种色素的加标回收率均在82%以上,RSD低于8% 。该方法较好地满足了藻类样品中色素含量的测定要求。

2.3 样品测定

藻种收获时先用显微镜进行细胞计数,分别取100 mL赤潮异弯藻(NMBRah03-2)、赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)、卡罗藻(NMBjah047-1)、微小原甲藻(NMBjah042)、微拟球藻(NMBluh014)、蛋白核小球藻(NMBluh015-1)、颗石藻(NMBjih026-1)、定鞭金藻(NMBjih029)、中肋骨条藻(NMBguh004-1)、威氏海链藻(NMBguh021)和假微型海链藻(NMBguh005),测定藻的密度分别为2.75×105、8.25×104、7.75×104、8.25×104、1.75×105、6.76×104、2.00×105、7.25×105、2.18×106、3.95×104和1.40×106 cell/mL。然后按照所建立的方法对每个藻种进行处理,每个样品平行上机检测3次。线性方程计算结果显示:叶绿素a和 β ,β -胡萝卜素存在于所有检测的藻种中,其中叶绿素a含量在颗石藻(NMBjih026-1)中最高(6.19×10-3 ng/cell)，在赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)中最低(4.42×10-5 ng/cell); β ,β -胡萝卜素含量在赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)中最高(6.65×10-4 ng/cell)，在微拟球藻(NMBluh014)中最低(1.75×10-5 ng/cell);叶绿素b仅在微拟球藻(NMBluh014)和蛋白核小球藻(NMBluh015-1)中检测到,含量分别为1.46×10-5和7.85×10-6 ng/cell;叶黄素仅在微拟球藻(NMBluh014)和蛋白核小球藻(NMBluh015-1)中检测到,含量分别为1.53×10-6和1.21×10-6 ng/cell;岩藻黄素在赤潮异弯藻(NMBRah03-2)、赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)、颗石藻(NMBjih026-1)、定鞭金藻(NMBjih029)、中肋骨条藻(NMBguh004-1)、威氏海链藻(NMBguh021)和假微型海链藻(NMBguh005)中检测到,其中在赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)中含量最高(4.17×10-4 ng/cell),假微型海链藻(NMBguh005)中含量最低(1.57×10-5 ng/cell)。藻种样品检测结果如表4所示。所测得的藻种中5种色素含量基本上与文献[18, 19, 20, 21]一致。本方法可对保留时间相同的色素进行一次性定量分析,且灵敏度较高,因此采用该方法分析色素更加高效,为今后的藻群组成及藻类生物量测定提供了测定方法。由于除了上述5种色素外,其余色素未能购买到或者价格较为昂贵,本文未进行藻类生物量的测定,后续将开展色素的纯化工作,为进一步进行藻类生物量的相关研究提供物质基础。

表4 实际藻种样品中5种色素的含量 Table 4 Contents of the five pigments in real alga samples
3 结论

本文对反相C16氨基柱高效液相色谱-三重四极杆质谱联用系统分析色素的方法进行了有效性验证,包括方法的线性关系、相关系数、检测限和定量限、精密度和回收率等。利用该方法分析比较了11种藻类中5种色素的分布情况,发现颗石藻细胞内的叶绿素a、赤潮异弯藻(NMBRah03-2-2)细胞内的 β ,β -胡萝卜素和岩藻黄素含量均高于其他藻类,叶绿素b和叶黄素仅在绿藻中检测到。该方法分离度好、灵敏度高、重复性好,为今后利用色素含量进行藻种分类及藻群组成分析提供了实验分析手段。

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