LC-30AD XR液相色谱(日本岛津公司); AB Qtrap 5500四极杆质谱(美国Applied Biosystems公司); ME36S天平、ME614S天平(德国Sartorius公司); SIGMA 3-18K离心机(德国Sigma公司); KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); Vortex-Genie 2型涡旋混合器(美国Scientific Industries公司); MCX固相萃取柱(mixed-mode cation exchange SPE column,混合型阳离子交换固相萃取柱,6 mL,150 mg,美国Waters公司); PCX固相萃取柱(polymer cation exchange SPE column,聚合物型阳离子交换固相萃取柱,6 mL,150 mg,美国Agilent公司),PCX固相萃取柱(6 mL,150 mg,天津博纳艾杰尔科技有限公司),Supel MIP^TM clenbuterol LRC(large reservoir cartridges,大容量柱,10 mL,25 mg,美国Supelco公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司);异丙醇(色谱纯,美国Fisher公司);甲酸(分析纯,北京化工厂);盐酸克伦特罗纯品(纯度99.3%±0.7%(k=2),中国计量科学研究院);同位素标记克伦特罗(D9-clenbuterol,纯度＞99.9% ,德国WITEGA公司)。

准确称量盐酸克伦特罗及D9-同位素标记克伦特罗标准品适量,分别用甲醇配制成 1000 mg/kg(以克伦特罗计)标准储备液。分别准确称量标准储备液适量,用0.1%(v/v)甲酸水溶液分别稀释成20μ g/kg 的标准工作液。用空白基体溶液作为稀释溶剂,配制标准校准溶液,克伦特罗浓度为0.92μ g/kg,D9-克伦特罗浓度为1.09μ g/kg。

提取:称取0.5 g猪肉冻干粉样品,加入1.5 g水复溶,加入D9-同位素标记克伦特罗标准工作液,混匀,静置过夜；样品中加5 mL水,匀浆1 min,用5 mL水清洗匀浆刀头后与匀浆液合并,超声提取10 min；加入10 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液,涡旋2 min,振荡10 min,12000 r/min(4 ℃)下离心15 min,取上清液；残留物重复提取一次,合并上清液；12000 r/min(4 ℃)下离心15 min,转移所有上清液至100 mL茄形瓶中,再加入10 mL异丙醇,50 ℃水浴中旋转蒸发去除大部分溶剂,转移残留水溶液至10 mL容量瓶,少量水清洗旋蒸瓶,清洗液转移至容量瓶,用水定容,摇匀,过0.45μ m聚醚砜(PES)滤膜,滤液待净化。

SPE净化:PCX(MCX)固相萃取柱依次经5 mL甲醇、5 mL水、5 mL 0.2%(v/v)甲酸水溶液活化;10 mL样品溶液全部上样;依次用5 mL 0.2%(v/v)甲酸水溶液和5 mL 50%(v/v)甲醇水溶液淋洗后真空抽干;再用5 mL正己烷淋洗后真空抽干;用10 mL 5%(v/v)氨化(乙酸乙酯-甲醇(2 ∶ 1,v/v))混合溶剂洗脱,真空抽干。

MIP固相萃取柱经1 mL甲醇、1 mL水和1 mL 25 mmol/L 乙酸铵缓冲液活化,上样1 mL标准工作溶液,用1 mL水淋洗,真空抽干2 min,再依次用1 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液和1 mL 0.5 mol/L 乙酸铵缓冲液(pH 5)淋洗,真空抽干2 min,最后用1 mL 10%(v/v)乙酸甲醇溶液洗脱2次。

洗脱液在45 ℃下用氮气吹至近干,用2 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液复溶,过0.22μ m PES滤膜,上机测试。

LC条件:色谱柱为ACQUITY CSH C₁₈ (100 mm×3.0 mm,1.7μ m);流动相A为乙腈,流动相B为含0.1%(v/v)甲酸的乙腈-水(20 ∶ 80,v/v)。梯度洗脱程序:0～5.0 min,100%B; 5.0～5.1 min,100%B～30%B; 5.1～9.0 min,30%B; 9.0～9.1 min,30%B～100%B; 9.1～15.0 min,100%B。流速:0.2 mL/min;进样量:20μ L。

MS条件:电喷雾离子源(ESI)；正离子多反应监测(MRM)模式;喷雾电压(IS): 1500 V;去簇电压(DP): 40 V;射入电压(EP): 13 V;碰撞室射出电压(CXP): 14 V;气帘气压力(CUR): 0.10 Pa;温度(TEM): 600 ℃;雾化气压力(GS1): 0.34 Pa;辅助气压力(GS2): 0.41 Pa。克伦特罗定量离子对:m/z 277.0/203.0(碰撞能量(CE): 25 eV);克伦特罗定性离子对:m/z 277.0/168.0(CE: 45 eV)、m/z 277.0/132.0(CE: 45 eV); D9-克伦特罗定量离子对:m/z 286.0/204.0(CE: 24 eV)。

采用卡尔费休法和烘干法测量猪肉冻干粉样品中的水分含量,取两种测量方法的平均值作为检测结果。

使用流动注射分析模式(flow injection analysis,FIA)比较了流动相中有机溶剂为乙腈或甲醇、添加甲酸改性剂等条件下克伦特罗的最优喷雾电压与质谱响应(见图1)。实验结果表明:相同比例的甲醇或乙腈为流动相时,最优IS值没有差异,但乙腈为流动相时克伦特罗的响应值更高;流动相中加入0.1%(v/v)甲酸后,最优IS值从 3000 V降至 1500 V,同时克伦特罗的响应值降低;有机相的体积分数从30%提高到90%时,最优IS值从 1500 V升高到 2500 V,克伦特罗的响应值明显升高,说明有机溶剂能够明显提高离子化效率。上述实验结果与已报道的IS值(5500 V^[4]、3500 V^[19])差异较大,其主要原因在于流动相的组成对克伦特罗离子化的影响。

图1

Fig. 1

图1 不同流动相组成下克伦特罗的最优IS值及质谱响应值 Fig.1 Optimal IS values and responses of clenbuterol with different mobile phase compositions Mobile phase 1: acetonitrile (or methanol)-water (30 ∶ 70,v/v); mobile phase 2: acetonitrile (or methanol)-0.1% (v/v) formic acid (30 ∶ 70,v/v); mobile phase 3: acetonitrile (or methanol)-0.1% (v/v) formic acid (90 ∶ 10,v/v).

β ₂-受体激动剂常以硫酸轭合物或葡萄糖醛酸轭合物的形式存在,为了更准确地测定样品中的待测组分,待测物往往要先酶解再提取^{[20, 21]}。但是也有文献^{[7, 20, 21, 22]}报道克伦特罗属于苯胺型结构,轭合反应率和蛋白质结合率低,大部分以游离态存在,酶解步骤可以省略。经实验考察发现酶解对克伦特罗的提取率几乎没有影响,所以本实验方法中未选择进行酶解步骤。

2.3.1提取溶剂的选择

由于猪肉基质复杂,蛋白质、脂肪含量较高,所以提取溶剂的选择应考虑在最大程度上提取目标物的同时去除蛋白质。实验比较了0.2 mol/L 高氯酸-甲醇(1 ∶ 9,v/v)、0.2 mol/L 磷酸-甲醇(1 ∶ 4,v/v)、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液3种提取溶剂对克伦特罗的提取效果(见图3)。结果表明:0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液的提取效率最高,且高氯酸和磷酸溶液提取出来的内源性杂质较多。同时比较了3种情况下样品溶液的基质效应,发现0.2 mol/L 高氯酸-甲醇(1 ∶ 9,v/v)的样品溶液基体抑制效应较为严重,基体抑制率高达45% ; 0.2 mol/L 磷酸-甲醇(1 ∶ 4,v/v)的基体抑制率为25% ～30% ; 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液的样品溶液基体抑制效应最小,基体抑制率为15% 。综合考虑,选择0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液作为提取溶剂。

图3

Fig. 3

图3 不同提取溶剂下克伦特罗的提取离子色谱图 Fig.3 Extracted ion chromatograms of clenbuterol with different extraction solvents a. 0.2 mol/L perchloric acid-methanol (1 ∶ 9,v/v); b. 0.2 mol/L phosphoric acid-methanol (1 ∶ 4,v/v); c. 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile.

2.3.2提取方法的选择

本研究选用克伦特罗的测定结果为指标,对超声时间、振荡时间、提取次数和提取溶剂用量4个因素进行了考察,选用L₉(3⁴)正交表进行重复试验(n=3),因素与水平安排见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 正交实验因素水平设计表 Table 1 Level of factors of orthogonal design experiment Level Time of ultrasound/min Time of vibration/min Times of extraction Volume of extraction solvent/mL 1 0 60 1 20 2 30 30 3 10 3 60 0 2 15

表1 正交实验因素水平设计表 Table 1 Level of factors of orthogonal design experiment

实验结果表明:9次试验克伦特罗的提取率差异不大,提取平均值为 3.0737 ng/g,极差仅为 0.1419 ng/g。所以过长的超声和振荡时间、过多的提取溶剂和提取次数并不能有效提高猪肉中克伦特罗的提取效率。采用单因素实验考察了匀浆对克伦特罗提取率的影响,结果见表2。在猪肉前处理过程中,匀浆在提取过程中起关键性作用。综合考虑,确定提取方法为匀浆1 min,振荡10 min,超声10 min,使用10 mL提取溶剂提取2次。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2匀浆对克伦特罗提取的影响(n=3) Table 2 Effect of homogenate on the extraction of clenbuterol (n=3) Treatment Average content/(ng/g) RSD/% Without homogenate 0.1921 13.71 Homogenate for 1 min 2.4829 0.18

表2匀浆对克伦特罗提取的影响(n=3) Table 2Effect of homogenate on the extraction of clenbuterol (n=3)

在0.2～2μ g/kg 的克伦特罗标准工作溶液中加入1.0μ g/kg 的D9-克伦特罗同位素内标,以分析物与内标物峰面积的比值y对分析物含量x( μ g/kg)做标准曲线,得到标准曲线方程为y=1.3369x+0.0794(r²=0.9999)。以S/N大于3确定方法的检出限为0.2μ g/kg,以S/N大于10确定方法的定量限为0.7μ g/kg。以市售阳性猪肉样品进行精密度考察,测定值的相对标准偏差(RSD)为2.68%(n=5)。

对于基质复杂的样品,基体抑制效应严重,即使采用同位素稀释质谱法也不能完全消除基质效应对结果的影响,且目标物与其同位素标记物受到的基体抑制效应的影响还存在差异。为了最大程度上消除基质效应对结果的影响,实验采用空白基体溶液配制校准溶液,比较了标准加入法、单点法和括弧法3种不同的定量方法,结果见表4。

由表4可以看出括弧法与单点法的结果相差不大,而标准加入法与二者结果相差较大。因为比对样品量有限,只能采用提取溶液进行标准加入法实验,可能会有一定程度的偏差,所以标准加入法不适用于样品量较少的比对试验。而括弧法与单点法的测定结果相近,但括弧法分析样品时较单点法所需分析时间多一倍且计算相对复杂,而结果并没有明显优势,所以综合考虑方法的准确性、精密度和时效性,本比对试验选择单点法进行校准。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表43种定量方法结果的比较(n=3) Table 4Comparison of the results of three quantitative methods (n=3) Quantitative method Average content/(ng/g) RSD/% Brackets 4.7362 0.29 Single point 4.7395 0.20 Standard addition 3.8647 3.13

表43种定量方法结果的比较(n=3) Table 4Comparison of the results of three quantitative methods (n=3)

克伦特罗含量按以下公式计算:

根据比对样品测试方法和含量计算公式进行不确定度分析。测定结果的不确定度来源主要包括测定结果的重复性引入的不确定度、提取效率的不确定度、水分测定的不确定度、基质效应引入的不确定度,以及由克伦特罗标准物质引入的不确定度和样品称量等过程引入的不确定度组成。不确定度的来源见表5,计算结果见表6。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5不确定度来源 Table 5Source of uncertainties Source of uncertainty x u(x) u(x)/x/% Method precision 3.69 My/g 0.1 9.20×10-5 0.092 Mx/g 0.5 9.20×10-5 0.018 Myc/g 0.1 9.29×10-4 0.929 Mzc/g 0.1 9.93×10-4 0.993 Fdrymass 0.9011 0.0157 1.74 FE 1 0.02 2.00 FI 1 0.01 1.00 x: variate,u(x): standard uncertainty; u(x)/x: relative standard uncertainty.

表5不确定度来源 Table 5Source of uncertainties

表5

Table 5

表5(Table 5)

表6 不确定度计算结果 Table 6Analysis results of uncertainties Uncertainty Analysis result uc 4.9% k 2 Uc 9.8% Cx 5.18 μg/kg ux 0.25 μg/kg Ux 0.50 μg/kg uc: relative combined standard uncertainty; k: coverage factor; Uc: relative expanded uncertainty; ux: combined standard uncertainty; Ux: expanded uncertainty.

表6不确定度计算结果 Table 6Analysis results of uncertainties

采用同位素稀释质谱法对APMP. QM-S6国际比对样品进行测定,比对样品中克伦特罗的含量为5.18μ g/kg±0.50μ g/kg (k=2)。图6是7个比对实验室测定猪肉中克伦特罗含量的结果,分布在2.457～9.97μ g/kg 范围内,与最终参考值(SCRV)5.20μ g/kg±0.06μ g/kg 比较,偏差在-52.75% ～91.73%之间。本实验室(NIM)结果为5.18μ g/kg,与参考值的差异为0.38% ,取得国际互认。各实验室之间测定结果偏差较大说明该测定存在较大难度。主要原因是克伦特罗的含量水平低,提取及基体中内源性干扰物质去除、质谱检测等均可能会影响分析结果的准确度。

图6

Fig. 6

图6不同实验室测定比对猪肉样品中克伦特罗含量(APMP. QM-S6)的结果 Fig.6 Results of clenbuterol in porcine meat from different laboratories (APMP. QM-S6)