ERY购自北京普博欣科技有限公司;MAA、EGDMA均购自Sigma公司;偶氮二异丁腈(azodiisobutyronitrile,AIBN)、磷酸二氢铵(分析纯)均购自上海国药控股有限公司。乙腈、甲醇均为色谱纯，购自天津科密欧化学试剂公司。

Agilent 1200系列高效液相色谱仪(Agilent公司,美国);固相萃取仪(Supelco公司,美国); SHB-Ⅲ循环水式真空泵(郑州恒岩仪器有限公司); DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(武汉德力祥仪器设备有限公司); SB 25-12 DTD型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司); KS 103B型振荡摇床(IKA公司,德国); FEI Quanta 200高分辨环境扫描电镜(FEI公司,荷兰)。

色谱柱:Waters SunFire^TM C18柱(250 mm×4.6 mm,5μ m);流动相:25 mmol/L 磷酸二氢铵溶液(pH 3.0)/乙腈(3 ∶ 7,v/v);流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样体积:10μ L;检测波长:210 nm。

参照本实验室已有的工作^[10],利用沉淀聚合法合成ERY分子印迹聚合物。具体合成步骤为:将1.5 mmol ERY与6 mmol MAA加入到50 mL的甲醇/乙腈(1 ∶ 4,v/v)混合溶液中,超声溶解,混合物于40 ℃恒温水浴中孵育过夜。加入15 mmol EGDMA和40 mg AIBN,通氮气除氧10 min后密封,于60 ℃恒温水浴中搅拌反应24 h。反应结束后,离心收集所得聚合物,用甲醇/乙酸(9 ∶ 1,v/v)溶液洗脱至无模板分子,然后用甲醇再次洗涤至无乙酸残留,最后将聚合物置于通风橱中干燥至恒重。

非印迹聚合物(non-imprinted polymers,NIPs)的制备除不加模板分子外,其他与MIPs制备方法相同。

取一组等量的MIPs和NIPs各25 mg于2 mL的离心管中,加入1 mL不同质量浓度(0.1～4.0 g/L)的ERY乙腈溶液。将混合物放到摇床上于室温下振荡24 h,将吸附液离心10 min并过0.22μ m滤膜,供HPLC分析。

准确称取100.0 mg的MIPs和NIPs,分别填充于聚丙烯固相萃取空管中。预先在空管底端放入一层聚乙烯筛板,压紧聚合物,使其表面平齐,上面再放置一层筛板,用玻璃棒推挤筛板压实聚合物,使筛板和聚合物粉末间紧密结合。

猪肉样品购自本地的超市,并通过LC-MS检查未检测到红霉素的存在^[11]。将猪肉样品完全粉碎。准确称取粉碎的猪肉样品10.00 g(精确至0.01 g)置于50 mL聚四氟乙烯离心管中,加入500μ L 1.5 mol/L NaOH溶液以去除样品中的脂质^[12],然后加入20 mL乙腈溶液,涡旋10 min,于 7000 r/min 下离心5 min。上清液转移至100 mL锥形瓶中，于45 ℃下旋转蒸发,最后用3 mL乙腈重新溶解残渣，待MISPE净化。

取制备好的MISPE小柱,对萃取条件进行系统优化,优化后的萃取条件为:依次用3 mL甲醇和3 mL乙腈活化小柱,加入3 mL上述提取液到小柱中,然后用3 mL乙腈/水(4 ∶ 1,v/v)溶液对小柱进行淋洗,最后用3 mL甲醇/磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0,0.1 mol/L) (3 ∶ 2,v/v)混合溶液洗脱;收集洗脱液,用氮吹仪吹干,用流动相溶解并定容至1 mL,供HPLC分析。

由图1可以看出,制备得到的MIPs是一种蜂窝状的高度交联聚合物,与NIPs相比,表面凹凸不平,孔隙较多,立体效果更加明显。这可能是由于模板分子与功能单体形成聚合物,聚合物去除了印迹分子,使得孔隙增多、变大,进而促进聚合物表面立体结构的形成^[13]。

图1

Fig. 1

图1(a)分子印迹聚合物和(b)非印迹聚合物的扫描电镜图 Fig.1 SEM photographs of (a) MIPs and (b) NIPs

静态平衡吸附法通常被用来考察分子印迹聚合物对模板分子的亲和性能,图2a为MIPs和NIPs的等温吸附曲线。聚合物的吸附量可以根据式(1)求得。

Scatchard分析法是研究MIPs吸附性能的经典方法^[15]，通过将平衡结合曲线转换为直线,得到聚合物对模板分子的结合位点个数以及聚合物的最大表观结合量。式(2)是Scatchard分析法研究MIPs和NIPs的结合特性的公式。

图2

Fig. 2

图2(a)等温吸附曲线和(b)MIPs及(c)NIPs结合ERY的Scatchard曲线 Fig.2 (a) Binding isotherms and Scatchard plots of the binding of ERY to (b) the MIPs and (c) NIPs

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 ERY在MIPs和NIPs上的吸附参数 Table 1 Parameters of ERY adsorption on MIPs and NIPs Polymer Qmax1/(mg/g) Qmax2/(mg/g) Kd1/(g/L) Kd2/(g/L) MIPs 45.24 87.53 0.028 0.20 NIPs 16.98 29.68 0.027 0.17

表1 ERY在MIPs和NIPs上的吸附参数 Table 1 Parameters of ERY adsorption on MIPs and NIPs

上样溶剂对吸附剂与分析物作用的微环境、分析物的稳定性具有至关重要的作用^[7]。一般而言,上样溶剂多选择与致孔剂性质类似的溶剂,以保证MIPs能特异性识别模板分子。因此,本研究考察了3 mL不同乙腈含量(0、20% 、40% 、60% 、80% 、100% ,v/v)的乙腈/甲醇溶液对MISPE回收率的影响,结果如图3a所示。结果表明:随着乙腈用量的增加,MISPE对ERY的吸附效率逐渐增加,当用100%乙腈作为上样溶液时,MISPE的吸附效率达到最大,为95.78% 。因此本实验选择乙腈作为最佳的上样溶剂。

图3

Fig. 3

图3不同(a)上样溶剂、(b)淋洗溶剂和(c)洗脱溶剂对MISPE的影响 Fig.3 Influences of different (a) loading solvents, (b) washing solvents and (c) elution solvents on MISPE b. washing solvents: 1. methanol/water (2 ∶ 3,v/v); 2. methanol/water (1 ∶ 1,v/v); 3. methanol/water (4 ∶ 1,v/v); 4. acetonitrile/water (2 ∶ 3,v/v); 5. acetonitrile/water (1 ∶ 1,v/v); 6. acetonitrile/water (4 ∶ 1,v/v).c. PBS: phosphate buffer solution (pH 7.0,0.1 mol/L).

淋洗溶剂的作用主要是洗去非特异性吸附的物质(如样品基质),保留与MIPs特异性结合的分析物,达到去除样品杂质的目的^[17]。本研究分别采用3 mL的甲醇/水(2 ∶ 3,v/v)、甲醇/水(1 ∶ 1,v/v)、甲醇/水(4 ∶ 1,v/v)、乙腈/水(2 ∶ 3,v/v)、乙腈/水(1 ∶ 1,v/v)、乙腈/水(4 ∶ 1,v/v)作为淋洗溶剂,探讨6种淋洗溶剂对萃取效率的影响。从图3b可以看到,当采用乙腈/水(4 ∶ 1,v/v)作为淋洗溶剂时,MISPE的回收率达到92.35% ,而非印迹固相萃取(non-imprinted solid phase extraction,NISPE)的回收率低于45% 。因此选择乙腈/水(4 ∶ 1,v/v)作为最佳的淋洗溶剂。

由于乙酸能与目标物竞争单体的功能位点,破坏二者之间的功能键,因而甲醇与乙酸的混合物经常被用作洗脱溶剂^[3]。然而,ERY在酸性环境中不稳定,在甲醇/乙酸(9 ∶ 1,v/v)溶液中5 h完全降解。由于目标物和MIPs之间的作用力可以被离子作用力破坏^{[18, 19]},因此本研究比较了不同甲醇含量(0、20% 、40% 、60% 、70% 、100% ,v/v)的甲醇/PBS(pH 7.0,0.1 mol/L)溶液对萃取回收率的影响。当甲醇含量大于70%时,混合物中会有结晶盐析出。图3c结果显示:随着甲醇在洗脱溶剂中比例的升高,ERY回收率逐渐增大,当甲醇比例为60%时,回收率达到最大。该结果表明:离子作用力是ERY与MIPs之间的主要作用力,离子强度的改变明显影响二者之间的相互作用力。因此采用60%甲醇/PBS(pH 7.0,0.1 mol/L)溶液作为MISPE的最佳洗脱溶剂。