芳基丙酸类药物是一类重要的非甾体类抗炎药物(NSAIDs),具有解热、镇痛、抗炎、抗风湿等作用,主要包括氟比洛芬、普拉洛芬、布洛芬、萘普生、洛索洛芬等[1, 2]。对于NSAIDs的广泛用药,美国食品药品监督管理局(FDA)明确指出NSAIDs存在潜在的心血管和消化道出血风险,这引起了医药界对这类药物用药安全的重视。芳基丙酸类药物在 α 位手性碳上连有一个羧基和一个苯基(见图1),有2个或2个以上立体异构体,且各异构体在药理活性、毒理作用和治疗作用上各不相同[3],如:氟比洛芬(flurbiprofen)作为一种新型的NSAIDs,起主要作用的是S-对映体,由于R-对映体的存在,有关的不良反应和毒副作用也逐渐被发现[3, 4],但其R-对映体可防治阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)[5, 6]。迄今为止,除了萘普生以S-对映体形式使用外,其他药物在市场上和临床应用中大多是外消旋体。为了减少毒副作用,避免发生不良反应,提高药物利用度,以及控制芳基丙酸类药物的质量,涉及这类手性对映体药物的研究越来越引起重视[1, 7, 8, 9, 10]。
目前色谱手性拆分在手性药物对映体分离、药理和药效研究以及质量检测中应用广泛,其中除了利用在流动相中添加手性拆分剂外,还可以采用更方便、效果更好的多糖、蛋白质和大环抗生素等手性固定相(CSP)进行拆分[11, 12, 13, 14]。在这些CSP柱中,采用纤维素和直链淀粉衍生物的报道较多,已成功用于多种手性化合物的正相色谱拆分[13, 14, 15, 16]。近年来利用反相色谱拆分引起了人们的重视,Younes等[17, 18]评价了9种多糖CSPs对58种化合物的拆分能力,其中直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)(ACMPC)和纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)(cellulose-tris-(4-methylbenzoate),CTMB)等多糖衍生物具有较高的反相手性拆分的选择性,但仅提到在酸性介质中可以拆分氟比洛芬和布洛芬,未见更详细报道。采用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和CTMB等固定相在正相色谱条件下可实现洛索洛芬、酮洛芬、布洛芬等药物的手性拆分[16, 19, 20],但流动相多为价格较高的正己烷,且易挥发。笔者曾用ACMPC柱分离了舒必利、阿米舒必利和莫沙必利3种抗精神病药物的对映体[21],但在拆分氟比洛芬、普拉洛芬、萘普生、布洛芬和洛索洛芬时仅有氟比洛芬对映体的分离度(Rs)大于1.5,而其他4种药物的拆分效果还不尽人意。本文以甲醇(或乙腈)-水作为流动相,在反相色谱条件下研究了氟比洛芬、普拉洛芬、萘普生、布洛芬和洛索洛芬等5种常用的芳基丙酸类药物在CTMB固定相上的手性色谱拆分行为及其拆分机理,建立了测定这5种药物对映体的分析方法。结果表明,采用RP-HPLC法在CTMB手性固定相上可以拆分氟比洛芬、普拉洛芬、萘普生、布洛芬和洛索洛芬等5种芳基丙酸类药物的对映体,据此建立的方法应用于上述5种药物有关制剂的含量分析,结果较为满意。
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司); DL-360A超声清洗器(上海之信仪器有限公司)。
R-氟比洛芬(美国Sigma公司,纯度98% );氟比洛芬消旋体标准品(美国Sigma公司,纯度98.5% );布洛芬、洛索洛芬钠、萘普生和普拉洛芬原料药(用其制备的标准品纯度不低于98% ),普拉洛芬滴眼液(千寿制药株式会社);萘普生胶囊(重庆科瑞制药有限公司);布洛芬缓释胶囊(中美天津史克制药有限公司);洛索洛芬钠(沈阳一天生物制药有限公司);无水乙醇(分析纯,广州试剂厂);甲醇和乙腈(色谱纯,德国默克公司);甲酸(分析纯);纯水(屈臣氏)。
标准溶液的配制:分别称取10 mg氟比洛芬、布洛芬、洛索洛芬钠、萘普生、普拉洛芬标准品于25 mL的容量瓶中,用甲醇超声溶解,定容至刻度,配制成400 mg/L,使用时逐级稀释。
色谱柱:Phenomenon Lux 5u Cellulose-3(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:甲醇(或乙腈)-0.1%(v/v)甲酸溶液,使用时用0.22 μ m滤膜过滤;检测波长:245 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μ L;温度:25 ℃。
以乙腈-水为基础溶剂,根据芳基丙酸类药物的性质,试验了在水中分别加入0.1%(体积分数)甲酸和0.1%(体积分数)乙二胺添加剂对氟比洛芬、普拉洛芬、萘普生、布洛芬和洛索洛芬5种芳基丙酸类药物对映体分离的影响,结果见表1。
由表1可知,5种药物对映体在加入0.1%甲酸添加剂后,分离效果明显改善,但加入0.1%二乙胺后除氟比洛芬外,均不能提高分离度,而且色谱峰严重拖尾。故实验采用在流动相中加入0.1%甲酸作为抑制剂。
在室温下试验了以甲醇-0.1%甲酸和乙腈-0.1%甲酸为流动相及其不同比例对5种药物对映体分离的影响,结果见表2。
从表2可以看出,随着甲醇和乙腈体积比的减小,保留时间增加,分离度增大,但却发现峰形变宽,柱效降低。除萘普生外,以甲醇和乙腈作为流动相均能使各对映体分离度＞1.5(比较两者效果,使用甲醇分离度更高),因此除萘普生用乙腈较适合外,选择甲醇更适合氟比洛芬、普拉洛芬、布洛芬和洛索洛芬对映体的分离。
在合适的流动相条件(氟比洛芬(甲醇-0.1%甲酸,90 ∶ 10,v/v)、普拉洛芬(甲醇-0.1%甲酸,90 ∶ 10,v/v)、萘普生(乙腈-0.1%甲酸,22 ∶ 78,v/v)、布洛芬(甲醇-0.1%甲酸,75 ∶ 25,v/v)、洛索洛芬(甲醇-0.1%甲酸,70 ∶ 30,v/v)下,分别考察了在柱温15～35 ℃时对上述5种药物对映体的色谱分离行为,结果见图2。
结果表明,5种手性药物对映体的Rs基本上是随着温度的升高而减小,计算得到的保留因子(k)和分离因子( α )等色谱分离参数也减小,这是因为在较低温度下可保持对映体稳定的手性构型，更易于与固定相发生作用。萘普生在25 ℃分离度最好,而洛索洛芬各对映体则是在25 ℃时4种对映体之间分离得更好。5种药物的对映体在CTMB色谱固定相上的分离行为虽有差异,但均能实现手性拆分,其色谱图见图3。
液相色谱手性拆分中,对映体在色谱固定相和流动相之间的分离是其自由能之差 ΔΔ G0所致,两对映体之间的分离因子 α 与其关系为[19]:
其中T是绝对温度,ΔΔ S0、 ΔΔ H0分别为被分离组分在固定相和流动相间分配的熵变之差和焓变之差。故以甲醇-0.1%甲酸为流动相,在15～35 ℃条件下,按优化的分离条件测定了各对映体的保留因子k,再通过ln k～1/T作图,分别计算了相应的热力学函数,结果见表3。
由表3可知,5种手性药物对映体分离过程的 Δ Δ G0值依次按普拉洛芬、氟比洛芬、洛索洛芬、布洛芬、萘普生顺序增大,但 Δ Δ G0均小于0,表明在CTMB固定相上的色谱拆分是可行的。萘普生的 Δ Δ G0值最大,即使通过调整流动相比例延长保留时间,其在固定相上的拆分效果也差。洛索洛芬4个对映体由于手性结构差异,也表现出不尽相同的色谱拆分效果。
纤维素具有D-葡萄糖构成单元而具有手性识别作用,但易于降解,通过衍生化后可保持其结构,同时提高了手性拆分的选择性。CTMB是纤维素的衍生物(见图4),由于在葡萄糖构成单元上连接了3个4-甲基苯甲酸酯基团,其手性拆分选择性不同于其他固定相[15, 17, 18]。为了了解CTMB固定相对上述5种芳基丙酸类手性药物手性拆分能力上的差异,采用乙腈-0.1%甲酸溶液流动相,比较和探讨了5种药物的混合溶液在CTMB固定相上的色谱分离行为。
从图5可知,5种药物与CTMB的相互作用力不同,其大小按色谱流出顺序依次为普拉洛芬、洛索洛芬、萘普生、布洛芬和氟比洛芬;但CTMB对上述药物的手性拆分能力则依次为:普拉洛芬＞氟比洛芬＞洛索洛芬＞布洛芬＞萘普生。除萘普生外,其余4种药物在CTMB上均能实现各对映体的分离,与热力学函数计算结果一致。这表明以CTMB作为固定相,5种药物由于复杂的相互作用其色谱保留行为和手性拆分行为表现了较大差异。按3点手性作用原理,5种药物在CTMB上的拆分作用主要来源于羧基、苯环及其连接的R1和R2基团与固定相形成的作用力(见图1): 5种药物在结构上均含有相同的母体结构,CSP可与芳基丙酸上的苯环和羧基作用以拆分各对映体,而实验结果表明取代基的影响更为明显,色谱保留作用大小并不能决定手性拆分能力。洛索洛芬、普拉洛芬和萘普生由于取代基极性较大,在极性较大的流动相中虽然显示保留能力比布洛芬和氟比洛芬弱,但拆分结果迥然不同:普拉洛芬、氟比洛芬和洛索洛芬由于在R1上有供电子基团、在R2上有电负性强的原子,与CSP上的羰基和苯环作用、氢键作用加强,额外的芳香基团也能促进 π - π 共轭辅助作用,有利于手性拆分,从而表现了比布洛芬更好的拆分效果。萘普生由于R1和R2位的共轭成环,萘环的刚性平面和空间位阻会妨碍对映体在CSP糖环上及其连接的羰基和苯环的多点作用,其手性拆分能力减弱。因此,除了CSP的氢键、偶极-偶极和手性空腔作用外,取代基也会影响4-甲基苯甲酸酯衍生基团的拆分选择性。
分别取市售的氟比洛芬片、普拉洛芬滴眼液、萘普生胶囊、布洛芬缓释胶囊和洛索洛芬钠片作为样品,精密称取各样品适量,用甲醇超声溶解,定容,取上清液过滤后按各药物的优化色谱条件进行测定,结果见表4。
结果表明,5种药物的各个对映体的线性相关系数良好(R2在 0.9899～0.9997 之间),测定的精密度在0.8% ～2.2%之间,结果较为满意。
采用CTMB手性固定相,系统地考察了流动相的组成、添加剂和柱温对氟比洛芬、普拉洛芬、萘普生、布洛芬和洛索洛芬对映体分离的影响,以及在CSP上的拆分机理。结果表明:除萘普生用乙腈-0.1%甲酸溶液外,以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相,5种药物的对映体均可在CTMB上实现色谱分离;CTMB与芳基丙酸母体尽管有一定的手性识别作用,但取代基的差异将直接影响手性拆分的效果。据此,分别选择各自合适的色谱条件建立了上述5种芳基丙酸类手性药物对映体的测定方法,并成功用于制剂中药物的含量测定,方法简便,可靠,准确。
2014, Vol. 32 Issue (9): 1013-1018
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