分子印迹的思想起源于分子识别当中“锁钥模型”概念,是通过制备对目标分子存在空间互补性结构[1]的分子印迹聚合物(MIP),实现对特定目标分子的高选择性识别,具有预定性(predetermination)、识别性(recognition)和实用性(practicability)等特点。与天然抗体相比,MIP具有制备原料易取,成本较低,可重复性使用,可耐受高温、酸碱、有机溶剂[2]等优势,通常被称为“人工抗体”[3]。
近年来,蛋白质印迹方法的研究取得了一定进展,并广泛应用于人造酶抑制剂[4]、色谱固定相[3]以及生物传感器[5]等多个领域。目前常见的印迹方法主要分为本体印迹法和表面印迹法,其中后者得到的印迹识别位点形成于印迹材料的表面,具有传质快、位点易于达到等优势[6, 7],因而表面印迹成为分子印迹发展的新趋势。传统的蛋白质印迹材料通常以整个蛋白质作为模板以获得识别位点。然而,这一全蛋白质印迹方式存在蛋白质体积较大、构象复杂且不易保持、对反应条件要求较为苛刻、模板固定化和洗脱较为困难等缺点[8, 9, 10],且得到的印迹材料对目标分子的选择性和识别效率还有待提高。为解决这一问题,近年来,Rachkov等[11, 12]首先提出了抗原决定基分子印迹策略,即采用蛋白质结构中暴露在表面的肽段(抗原决定基)作为模板分子,制备得到的分子印迹聚合物不但可以识别模板肽,也可以识别模板肽段对应的目标分子。该策略不仅克服了全蛋白质印迹策略存在的不足,而且具有成本低廉、模板分子易获得、基质表面模板固载效率高等优势[13, 14, 15]。当前,通常采用蛋白质的C末端或者N末端含7～11个氨基酸的多肽作为目标蛋白质的抗原决定基模板。
可逆加成-断裂链转移(RAFT)策略是一种新型的活性-可控聚合反应策略,1998年由Chiefari等[16]提出并广泛应用于多个领域的研究中。相对于传统自由基引发的聚合策略,RAFT具有形成聚合物相对分子质量范围可控、链长和相对分子质量分布较窄、聚合反应条件温和等优点[17, 18, 19, 20],解决了传统自由基聚合中聚合物链长度难以控制导致的功能聚合物层形貌不均的问题。这种方法近年来开始应用于分子印迹材料的制备[21, 22],以期获得聚合物链可控性更强、形貌更均一的印迹聚合物层,从而获得对目标分子更高的识别特异性。
本研究以转铁蛋白的N端抗原决定基九肽为模板,通过共价的方式将其固载于修饰了戊二醛的硅胶颗粒表面,然后通过RAFT反应制备抗原决定基表面印迹微球,并将其用于模板肽段以及其对应蛋白质的分子识别。
SUPRA55型扫描电子显微镜(Carl Zeiss公司),LC20AD型高效液相色谱仪(日本岛津公司),液相色谱柱(Hypersil C8填料,150 mm×4.6 mm,5μ m)。硅胶填料(粒径5μ m,孔径7 nm)购自日本富士化工(Kusugai),氨丙基三乙氧基硅烷(APTES,纯度99% )、甲基丙烯酸(MAA)购自Acros公司,转铁蛋白N端抗原决定基(ML-9,Met-Arg-Leu-Ala-Val-Gly-Ala-Leu-Leu)购自吉尔生化公司,转铁蛋白(transferrin,TF)、细胞色素C(cytochrome C,CYC)、 β -乳球蛋白( β -lactoglobulin,LAC)、甲基丙烯酰羟乙酯(HEMA)、甲叉基双丙烯酰胺(MBA)、戊二醛、偶氮二异丁腈(AIBN)和三硫酯试剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DMP)均购自Sigma-Aldrich公司,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自天津科密欧试剂公司。乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司。其余化学试剂均为分析纯。实验用水经Milli-Q超纯水处理系统纯化。
戊二醛硅球的制备:称取硅胶填料100 mg,加入1.0 mL甲醇与5.0μ L APTES混匀,反应24 h。反应后用过量甲醇洗涤后烘干,然后加入1.80 mL的水和0.20 mL 50%(v/v)的戊二醛反应2 h,反应后洗涤,烘干。
抗原决定基九肽的固载:称取制备好的戊二醛硅球20 mg,用10 mmol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)洗涤后,加入0.25 mL 2.0 mg/mL 的转铁蛋白抗原决定基溶液与0.75 mL 10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4),混匀后孵育3 h,然后用10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤2次后加入氰基硼氢化钠固体,待固体完全溶解后离心去除上清,洗涤后置于4 ℃下备用。
聚合反应和模板去除:将9.0 mL DMF、0.131 mL MAA、0.410 mL HEMA、144 mg MBA、9.19 mg AIBN和2.02 mg DMP混匀后,通氮气20 min以除去体系中的溶解氧,然后在每份固载抗原决定基材料中加入2.0 mL以上的预聚溶液,封口,于70 ℃下反应24 h。反应后用乙腈和去离子水各洗涤2次后,用1 mL 10%(v/v)的FA洗脱模板肽段3 h,用水洗净酸液后加入1.0 mL乙醇和0.10 mL正己胺反应过夜,然后加入0.05 mol/L 的酸性高锰酸钾溶液,混匀后反应1 h,反应后用10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤材料2次后烘干。
在制备以上分子印迹聚合物(RAFT-MIP)的同时,在不加入模板ML-9而其他制备条件均相同的情况下制备相应的空白印迹聚合物(RAFT-NIP)。此外,不加入RAFT试剂,改变溶剂DMF的量为18.0 mL,其他反应条件不变的条件下制备非RAFT印迹聚合物(control-MIP)与空白聚合物(control-NIP)。
电镜表征:场发射扫描电镜图像由Carl Zeiss公司SUPRA55型场发射扫描电子显微镜在15.0 kV的电压下获得。
材料对模板识别能力的考察:分别取20 mg的MIP与NIP材料,每份中加入1.0 mL 0.40 mg/mL 的抗原决定基(10 mmol/L PBS缓冲液,pH 7.4),4 ℃孵育24 h后用10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤2次。再用1 mL洗脱液(甲酸/乙腈/水(20 ∶ 40 ∶ 40,v/v/v))洗脱模板1 h,收集洗脱液。
材料对模板对应蛋白质识别能力的考察:分别取50 mg的MIP与NIP材料,每份中加入1.0 mL 0.40 mg/mL 的转铁蛋白(10 mmol/L PBS缓冲液,pH 7.4),于4 ℃孵育24 h后用10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤2次。再用1 mL洗脱液(甲酸/乙腈/水(20 ∶ 40 ∶ 40,v/v/v))洗脱模板蛋白质1 h,收集洗脱液。
材料对模板对应蛋白质识别动力学的考察:分别取50 mg的MIP与NIP材料,每份中加入1.0 mL 0.40 mg/mL 的转铁蛋白(10 mmol/L PBS缓冲液，pH 7.4),于4 ℃下分别孵育1、5、15、30、60、120 min后用10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤2次。再用1 mL洗脱液(甲酸/乙腈/水(20 ∶ 40 ∶ 40,v/v/v))洗脱模板蛋白质1 h,收集洗脱液。
材料对模板对应蛋白质选择性识别的考察:分别取50 mg的MIP与NIP材料,每份中加入0.50 mL质量浓度均为0.40 mg/mL 的细胞色素C、转铁蛋白与 β -乳球蛋白的溶液,于4 ℃孵育24 h后用10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤2次。再用1 mL洗脱液(甲酸/乙腈/水(20 ∶ 40 ∶ 40,v/v/v))洗脱模板蛋白质1 h,收集洗脱液。
以上洗脱液中的肽段或蛋白质浓度由液相色谱测得。色谱柱:C8填料,150 mm×4.6 mm,5μ m。流动相:A相,2%乙腈+98%水+0.1%TFA; B相,2%水+98%乙腈+0.1%TFA。梯度条件:0～40 min,20%B～90%B。流速: 1.000 mL/min;检测波长: 214 nm。
这一可识别转铁蛋白的抗原决定基RAFT印迹微球的制备流程如图1所示。首先,通过硅烷化试剂APTES在硅胶表面修饰氨基官能团,然后通过氨基和醛基形成Schiff碱的反应将戊二醛共价固载到硅胶表面。由于形成Schiff碱的反应是可逆的,因此在反应过后用NaCNBH3将Schiff碱的不饱和双键还原成稳定的单键。然后用同样的原理使端基带有醛基的硅胶与共价固载抗原决定基表面的氨基反应,从而使抗原决定基固载到硅胶表面。
在RAFT试剂的调控下进行印迹聚合反应,形成亲水性的有机聚合物印迹层。选择常用的亲水性单体MAA和HEMA、交联剂MBA、热引发剂AIBN,在70 ℃下与固载抗原决定基的硅胶混合,具有两亲性质的RAFT试剂DMP分散在溶剂中,聚合反应24 h。
聚合完成后,用1 mL 10%(v/v)的FA洗脱模板肽段3 h。在酸性条件下,通过对Schiff碱的解离将共价键合的肽段在印迹后从聚合物中除去,同时对形成的亲水性有机聚合物材料影响不大。由于聚合物链末端带有RAFT官能团的R基团为疏水性的十二烷基,为避免在后续肽段或蛋白质识别过程中出现非特异性吸附,采用10%(v/v)正己胺将RAFT试剂中的三硫酯官能团还原为巯基。最后,为了消除模板洗脱后材料上残余的醛基对肽段或蛋白质识别的干扰,使用酸性高锰酸钾溶液将醛基氧化为羧基,同时增加了材料的亲水性。
制得的抗原决定基分子印迹材料的扫描电镜图(SEM)如图2所示。制得的抗原决定基颗粒直径约5μ m,呈球形,微球之间没有因溶液聚合而出现粘连。微球表面光滑,形貌规则,这可能归功于RAFT试剂在制备微球的聚合反应中对聚合物链的调控作用。
考察了制备的材料对模板肽段的再识别性能。在实验条件下,测得以上的RAFT-MIP对Met-Arg-Leu-Ala-Val-Gly-Ala-Leu-Leu模板九肽的识别容量为2.36 mg/g,同样条件下制备的非印迹材料RAFT-NIP对以上九肽的识别容量为1.25 mg/g,印迹因子(IF,MIP识别容量/NIP识别容量)为1.89。同样条件下非RAFT印迹材料control-MIP对以上九肽的识别容量为3.00 mg/g,对应的control-NIP识别容量为2.42 mg/g,IF仅为1.24。以上结果证明了这种RAFT分子印迹材料对模板肽具有很好的识别能力,同时也印证了RAFT策略对聚合反应的调控作用。
进一步考察了材料对抗原决定基所对应的目标蛋白质的识别性能。在实验条件下,以上的RAFT-MIP材料对转铁蛋白的识别容量是4.98 mg/g,同样条件下制备的RAFT-NIP对转铁蛋白的识别容量为3.09 mg/g,IF为1.61。尽管这一印迹因子略低于肽段识别的印迹因子,不过仍可以证明材料对目标蛋白质的识别具有良好的选择性。而control-MIP印迹材料对转铁蛋白的识别容量为3.68 mg/g,control-NIP印迹材料对转铁蛋白的识别容量为3.10 mg/g,IF为1.19。通过RAFT材料与非RAFT材料对蛋白质识别容量和印迹因子的比较也进一步印证了使用RAFT试剂调控的优势。实验还进一步考察了以上蛋白质识别条件下,材料对模板蛋白质识别的动力学特征,动力学吸附曲线如图3所示。在60 min内识别的蛋白质可以达到识别总量的90% ,120 min内可以达到平衡吸附,吸附容量可以达到4.98 mg/g。
实验进一步考察了在等浓度多蛋白质存在的条件下,材料对模板蛋白质的选择性识别能力。如图4所示,在多种不同相对分子质量和等电点蛋白质共存的竞争识别当中,材料对转铁蛋白识别的印迹因子为1.57,而对细胞色素C与 β -乳球蛋白的印迹因子分别是0.261和1.35。这证明了RAFT策略制备转铁蛋白抗原决定基分子印迹微球对蛋白质混合物中的目标蛋白质有高选择性识别。
通过RAFT聚合反应制备转铁蛋白的N端抗 原决定基表面印迹微球,其不但可以识别抗原决定基九肽,还可以有效识别转铁蛋白,印迹因子分别为1.89和1.61;在多蛋白质竞争识别当中,材料识别转铁蛋白的印迹因子远高于其他蛋白质。RAFT策略可以用于制备抗原决定基分子印迹材料,制得的材料对模板抗原决定基及其对应的蛋白质具有良好的识别能力。
2014, Vol. 32 Issue (10): 1029-1033
PDF (2880KB)
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