多相微流控(multiphase microfluidics,亦称液滴微流控,droplet-based microfluidics)技术是当前微流控分析研究领域内的前沿技术之一。与单相微流控技术相比,多相微流控技术具有样品/试剂消耗少(nL-pL-fL)、分析通量高、反应效率高、样品无扩散、样品间无交叉污染等优点,在微量样品预处理和分析,以及多维分离领域具有广阔的应用前景。最近,Zenobi研究组^[1]将液滴微流控技术应用于纳流液相色谱(nano-LC)系统洗脱液馏分的间隔与收集,显著提高系统的分离分辨率。利用一个简单的T型管装置,连接液相色谱柱出口,流出的洗脱液首先在T型管内被油相(perfluorinated oil)间隔成纳升级的液滴,不互溶液滴的生成避免了在输运过程中样品区带的分散,因而可获得高的色谱分辨率。在T型管的出口,馏分液滴被以1液滴/s的速度滴加在一个高密度微阵列芯片上,点样过程由计算机程序控制三维平移台自动完成。该芯片采用带有铟锡氧化物(indium tin oxide,ITO)涂层的玻璃片加工,芯片面积为75×25 mm²,芯片上加工有 2 780 个亲水点,每个亲水点的直径为300 μ m,可承载2.5 nL的水相液滴。在45 min的色谱分离过程中,系统可产生 2 700 个液滴,因而系统可获得很高的时间分辨率。作者将该系统应用于胰蛋白酶酶解的蛋白质混合样品的色谱分离、馏分间隔与收集,以及后续的激光解吸离子化质谱(MALDI-MS)分析。与常规纳流液相色谱-质谱(ESI-MS)联用系统及标准的连续流点样系统相比,该系统所得到的色谱峰宽明显减小。此外,因采用高密度芯片可承载大量的馏分液滴,在实验中,还可采用在相邻液滴中加入两种不同MALDI基质的方法,以考察不同基质对同一色谱分离组分质谱检测性能的影响。

目前,文献已报道了多种用于微流控液滴系统的检测方法,如荧光法、吸收光度法、电化学分析法、质谱法等。近期,唐波研究组^[2]将微流控液滴技术与生物传感技术结合,实现了单个活细胞中膜蛋白的高灵敏检测。首先采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)基质芯片,利用汇流通道将单个细胞和反应试剂包裹进单个液滴中,液滴体积为300 pL。膜蛋白的检测是基于核酸适体和切口酶辅助信号放大(nicking enzyme assisted signal amplification)均相反应体系,利用激光诱导荧光检测器测定反应后液滴的荧光强度实现膜蛋白的定量分析。作者采用该系统测定了Hela细胞中膜蛋白 蛋白酪氨酸激酶-7(protein tyrosine kinase-7,PTK7)的含量。由于液滴系统反应体积微小,物质传质速度快,因而与常规试管体系相比,液滴内的反应速率提高了两个数量级,反应时间由原来的30 min缩短至17 s。

芯片毛细管电泳和快速毛细管电泳系统的优势是分离速度快,分离效率高,尤其适合应用于多样品体系的高通量筛选。但这一优势的发挥通常受到电泳系统工作可靠性的限制。在多样品分离过程中保持分离通道表面状态的一致性对确保毛细管电泳系统工作的可靠性至关重要。因此,有关毛细管电泳通道表面改性方法的研究一直是电泳研究中的重要领域。2013年,Kennedy研究组^[3]发展了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂筛选的快速毛细管电泳系统,该系统采用区带毛细管电泳模式,激光诱导荧光检测,并利用化学方法对CE毛细管通道内壁进行改性处理,以防止蛋白质的吸附。具体是采用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane)对毛细管通道表面进行处理,结果获得很好的工作稳定性。一根毛细管通常可完成500次蛋白质样品的分离。在分离过程中,为提高分离速度,在进样端施加3.4 kPa(0.5 psi)的正压力,以保证样品分离可在3 min内完成。该系统被应用于热休克蛋白(heat shock protein 70,Hsp70)与其伴侣分子Bcl2-associated anthanogene 3 (Bag3)相互作用抑制剂的筛选。首先利用荧光基团标记Hsp70,然后将其与Bag3和待检测化合物混合,利用激光诱导荧光检测-电泳系统分离结合与游离的荧光标记Hsp70,通过测定结合与游离Hsp70的峰面积之比考察待测化合物的抑制效应。该电泳系统可自动从96孔板中取样,每个样品的分析时间约为6.5 min,包括1 min清洗,5 s进样与3 min分离时间,分析通量可达到220样/天。作者构建了一个具有 3 443 种不同化合物的库,并对其进行了筛选。与经典流式细胞术方法比较,电泳图可提供更多的信息,因此电泳筛选方法可降低筛选的假阳性率,具有更好的特异性。

最近,Ramsey研究组^[4]报道了一种基于化学气相沉积(chemical vapor deposition,CVD)技术的玻璃微流控芯片通道表面改性方法,用于多肽和蛋白质的电泳分离。作者使用两种硅烷化试剂((3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)和(3-aminopropyl)di-isopropylethoxysilane (APDIPES))对芯片表面进行处理,并通过测定多个芯片的电渗淌度和电泳分离效率考察通道表面涂层的一致性。采用APDIPES处理的芯片获得了接近理论极限的高分离效率,并且其电渗淌度可在2.8~7.5的pH范围内基本保持不变。作者进一步考察了采用APTES和APDIPES处理芯片涂层的长时间稳定性。在1周的储存时间内,采用两种方式储存毛细管(4 ℃,真空;或者室温,毛细管内充满pH 2.8缓冲液),均可获得稳定的分离性能。作者采用具有23 cm长蜿蜒通道和集成化电喷雾喷头的玻璃芯片,以APDIPES处理芯片表面,并将其应用于多肽和蛋白质的毛细管电泳分离和在线质谱(ESI-MS)检测。在多肽分离中,在90 s分离时间内,可达到64的峰容量,分离效率超过 600 000 理论塔板数。在蛋白质分离中,也可获得对称的高斯电泳峰形和 100 000~400 000 的理论塔板数。