农药标准品: α -六六六(纯度98.0% )、 β -六六六(纯度98.5% )、 γ -六六六(纯度98.6% )、 δ -六六六(纯度99.0% )、甲基对硫磷(纯度98.5% )、扑草净(纯度98.0% )、马拉硫磷(纯度99.0% )、对硫磷(纯度99.0% )、p,p′-滴滴伊(纯度97.5% )、p,p′-滴滴滴(纯度99.0% )、o,p′-滴滴涕(纯度98.5% )、p,p′-滴滴涕(纯度98.5% )、硫丹(纯度99.0% )、三唑磷(纯度81.0% )、氰戊菊酯(纯度98.0% )、溴氰菊酯(纯度99.5% ),均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。N-丙基乙二胺粉(PSA,40～60 μ m,美国Agilent公司);石墨化炭黑粉(GCB,40～60 μ m,上海安谱科学仪器有限公司);乙腈(农残级)、丙酮(农残级)、二氯甲烷(农残级)、环己烷(色谱纯)、无水硫酸镁(分析纯,使用前于650 ℃灼烧4 h)、氯化钠(分析纯)。干紫菜样品购于青岛市农副市场。

农药标准溶液的制备:分别称取经折算相当于10.0 mg的农药标准品；六六六、滴滴涕、硫丹、氰戊菊酯和溴氰菊酯用甲苯溶解,甲基对硫磷、对硫磷、马拉硫磷和三唑磷用甲醇溶解,扑草净用丙酮溶解；定容至10.0 mL,配成1.0 g/L 的标准储备液,于-20 ℃贮存。混合标准溶液用丙酮稀释配制。

Thermo SorvallBiofuge Primo型离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)、Talboys型旋涡混合器(上海安谱科学仪器有限公司),BT224S分析天平(法国Sartorius公司),N-EVAP^TM112型氮气吹扫仪(美国Organomation公司),IS-RDS3型恒温振荡器(美国Crystall Technology & Industries公司)。

Shimadzu GPC-GC/MS 2010Ultra凝胶色谱-气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)。GPC系统包括:LC-10Advp泵、SIL-10Advp自动进样器、CTO-10ASvp柱温箱、ShodexCLNpak EV-200凝胶色谱柱(200 mm×2.0 mm)、SPD-10Avp紫外检测器、流动通道选择阀、SCL-10Avp系统控制器。GC/MS系统包括岛津QP2010Ultra,配有PTV-2010大体积进样器;惰性毛细管柱(5 m×0.53 mm)、预柱Rtx-5ms (5 m×0.25 mm×0.25 μ m)和分析柱Rxi-5ms (25 m×0.25 mm×0.25 μ m)，通过两通或三通串联使用,具体连接方式如图1所示。

本文考察了常用的丙酮、丙酮-二氯甲烷(1 ∶ 1,v/v)、乙腈3种溶剂的提取效果。对比研究发现,3种有机溶剂的提取效率都较好。在添加水平为50～100 μ g/kg 时,分析物的回收率为60% ～120% 。但是通过基质空白实验发现,丙酮的提取能力较强,样品中的色素等杂质在丙酮中溶解性较大;经丙酮和丙酮-二氯甲烷两种溶剂提取后,质谱图中的干扰较严重;而乙腈对脂肪和色素的溶解性较差,同时农药在乙腈中溶解性较好,提取之后得到的谱图干扰最少。因此选择乙腈作为样品提取剂可以在保证提取效率的同时减少杂质干扰。对乙腈的使用量也进行了优化,结果表明当乙腈量少于40 mL时,大部分农药组分的回收率较低;使用量达到40 mL时,所有组分回收率都大于70% ;继续增加乙腈的使用量,回收率没有明显增高。因此,为减少有机溶剂的使用,本实验选择乙腈用量为40 mL。

紫菜中含有较多的色素和其他营养成分及杂质,如果不能有效去除会对仪器造成污染,且杂质会影响对目标组分的准确定性和定量。比较C₁₈和PSA的净化能力，结果见图2。PSA是不规则的硅胶颗粒,同时具有伯氨基和仲氨基，可以更好地去除样品中的碳水化合物、脂肪酸和酚类等杂质的影响,同时能准确地定性和定量,此技术已应用于蔬菜中农药残留的分析^[17]。另外,由于GCB具有吸附能力,可以去除紫菜中大量色素和非极性杂质的干扰,本方法将乙腈提取液进一步用PSA和GCB净化。向提取液中同时加入PSA和GCB净化剂,并对使用量进行了优化。比较了10、30、50、100和200 mg的净化效果及回收率,表明当分散净化剂PSA和GCB的加入量都小于50 mg时,样品提取液较浑浊,且干扰峰多;当两种净化剂的加入量各为50 mg时,可有效去除紫菜提取液中的色素和脂类等杂质;当用量继续提高,由于净化剂对农药有一定的吸附作用,部分目标组分的回收率降低,净化效果没有进一步提高。为此,本试验选择分散净化剂PSA和GCB的用量各为50 mg。

样品按照1.3.1节处理后,经GPC进一步净化。在GPC色谱柱中根据相对分子质量的不同,将油脂、色素成分与农药分离;在GPC软件上,由氟胺氰菊酯和灭螨蜢标准样品的保留时间来确定农药的收集开始和结束的时间;GPC仪器上设置了A、B两个切换阀,通过两阀的切换可有效截取含有农药残留部分的馏分,排出油脂、色素等杂质,农药被收集到定量捕集环(200 μ L)中,然后将收集好的溶液推入气相色谱的PTV进样口,同时启动GC/MS程序,实现了GPC净化和GC/MS检测的在线联用。

GPC-GC/MS系统的进样量为10 μ L,比单独的GC/MS高5～10倍,同时利用在线凝胶系统又进一步去除提取液中的干扰成分,因此能够提高灵敏度,获得更低的检出限。

如表1所示，19种农药被分成了10组。由于市售农药中六六六(4种异构体)、滴滴涕(4种异构体)、硫丹(2种异构体)、氰戊菊酯(2种异构体)和溴氰菊酯(2种异构体)各自的异构体通常同时存在,将其异构体归为一组进行分析：六六六、滴滴涕和硫丹(10种农药归为3组),甲基对硫磷、马拉硫磷、对硫磷和三唑磷(4种农药归为4组),扑草净(1种农药归为1组),氰戊菊酯和溴氰菊酯(4种农药归为2组)。对1.0 mg/L 的农药混合标准溶液进行全扫描得到总离子流图,根据各农药的CAS号在质谱库中进行检索,查看标准质谱图,选择丰度相对较高、相对分子质量较大和干扰较少的碎片离子作为定性和定量的特征目标离子,根据实际质谱图确定各组分的保留时间(见表1),创建选择离子扫描方法。根据定量目标离子的峰面积,采用外标法定量。GPC净化所需时间为10 min,从图3可以看出,19种农药在GC/MS上分析所需时间不到40 min,GPC-GC/MS在线联用分析1个样品仅需50 min,实现了从试样进一步净化到分析检测的自动化,大大缩短了样品检测所需要的时间。且自动化的使用减少了人为操作的误差,重现性更好;因减少了有机溶剂的使用而降低了对人体和环境的危害。

用丙酮稀释,配制10～1000 μ g/L 系列质量浓度的混合标准溶液。混合标准溶液中的各组分以定量目标离子的峰面积与质量浓度作标准曲线。从表2可以看出,10组农药在10～1000 μ g/L 范围内呈较好的线性关系,相关系数(r)均大于0.995。此方法的检出限(LOD,以3倍信噪比计)为0.005～0.03 mg/kg,与文献^{[6, 18, 19]}报道的结果相当。参照2014年8月公布的国家标准^[7],检出限均低于食品中农药的最大残留限量,说明此方法已达到了国家限量检出要求。

挑选出阴性的紫菜作为空白样品基质,分别在50、100及200 μ g/kg 共3个水平进行农药加标试验,每个水平设置6个加标平行样,结果如表3所示。分析紫菜中每组农药(异构体合并计算)的添加回收率和相对标准偏差(RSD)可知,有机氯农药的平均回收率在73.2% ～94.4%之间,RSD为4.05% ～8.43% ;有机磷农药的平均回收率在81.4% ～112.6%之间,RSD为3.02% ～8.72% ;三嗪类农药的平均回收率在75.2% ～93.9%之间,RSD为5.45% ～6.79% ;菊酯类农药的平均回收率在89.6% ～112.1%之间,RSD为7.78% ～11.2% 。另外,连续3天对100 μ g/kg 的加标样品重复测试,RSD均小于15% 。说明该方法具有较好的日内和日间重复性;同时,方法简单、快速,回收率和精密度均能满足紫菜样品中农药多残留快速检测的要求。

取市售的12个紫菜样品,按1.3.1节的实验方法进行提取、净化和色谱-质谱测定,其中扑草净在7个样品中有不同程度的检出,含量范围为0.007～0.058 mg/kg;三唑磷在8个样品中有不同程度的检出,含量范围为0.044～0.184 mg/kg;其他农药组分在所有样品中均未检出。图4为一个实际样品的总离子流图。