Waters Symmetry C18分析柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m)(美国Waters公司); 3K30型高速冷冻离心机(德国Sigma公司); Optima L-80XP型超速离心机(美国Beckman公司); LC-MS/MS由HPLC系统(LC-20AD、DGU-20A3脱气机和SIL-20AC自动进样器,日本岛津公司)、串联质谱仪(4000 QTRAP,美国AB SCIEX公司)和氮气发生器(ABN2ZA,英国PEAK公司)组成。

NANA(纯度为99% )及甲醇、甲酸、醋酸、甲酸铵、槲皮素(纯度≥95% )购于Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;蛋白测定试剂盒购于美国Invitrogen公司;去离子水由Millipore纯水机制备;其他化学试剂为国产分析纯。

人血浆样本由泰山医学院附属医院提供。

19例健康人(41～59岁,平均年龄50.7岁)和17例Ⅱ型糖尿病患者(42～60岁,平均年龄51.6岁)的血浆样本采集于空腹12 h之后的早餐前。抗凝血液经 1 000 g离心力离心15 min后获得血浆。将新鲜血浆移入离心管,调密度d至1.006 g/mL,充N₂,封口。于10 ℃下以 40 000 r/min的转速离心24 h,取上层液体,获得极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL);下层液体调节密度d至1.063 g/mL,于10 ℃下以 40 000 r/min的转速离心48 h,获得低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL);剩余液体调密度d至1.21 g/mL,于10 ℃下以 40 000 r/min的转速离心48 h,得到高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)。脂蛋白经透析,充N₂,封口备用。

取20 μ g蛋白样本,加入pH=2的醋酸溶液200 μ L,80 ℃下水解,不同时间点取样,考察水解时间对唾液酸降解的影响,确定最佳水解时间。

本研究采用的色谱柱为Waters C18分析柱(Waters Symmetry,100 mm×2.1 mm,3.5 μ m),同时配备Waters保护柱(10 mm×2.1 mm,3.5 μ m)。流动相为含有4 mmol/L 甲酸铵和0.1%(v/v)甲酸的5%(v/v)甲醇溶液,线性洗脱。进样体积为5.0 μ L,流动相流速为0.3 mL/min。质谱采用电喷雾离子源(ESI)的多反应监测(MRM)模式,温度500 ℃,雾化气、辅助气和气帘气的压力分别设定为380、380和140 kPa,其中碰撞气设在中等档,在正、负离子模式下的喷雾电压(ion-spray voltage)分别为 4 500 V和-4 500 V。NANA的质谱分析参数见表1。数据使用AB SCIEX软件V1.6进行分析。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 NANA的质谱分析参数 Table 1 MS/MS parameters of NANA Ionization mode Quantitative ion (m/z) Collision energy/eV Declustering potential/V Positive 310.0/274.0 16.0 42.0 Negative 308.1/86.7 -18.0 -50.0

表1 NANA的质谱分析参数 Table 1 MS/MS parameters of NANA

用去离子水配制500 μ g/mL的NANA储备液,分装后于-20 ℃保存。通过标准样品添加回收率试验进行方法学验证。

实验组采用终浓度为10 μ mol/L的H₂O₂分别处理质量浓度均为10 μ g/mL的HDL和LDL;对照组另外添加终浓度为10 μ mol/L的槲皮素对脂蛋白进行保护。37 ℃下孵育6 h后终止,采用LC-MS/MS检测两组脂蛋白上的唾液酸含量。

采用SPSS17.0进行统计学分析。数据以“平均值±标准差”的形式表示。组间比较采用t检验,P≤0.05则具有显著性差异。

NANA是哺乳动物体内唾液酸的主要存在形式。本研究分别在正、负离子模式下对NANA的质谱分析条件进行了优化。最终确定NANA在正、负离子模式下的监测离子对分别为m/z 310.0/274.0和m/z 308.1/86.7。在正、负离子模式下,NANA的典型质谱碎片如图1所示。经比对分析,NANA在负离子模式下检测结果所得S/N比值最佳,因此本文均采用该条件进行脂蛋白唾液酸含量分析。

图1

Fig. 1

图1 NANA在(a)正、(b)负离子模式下的二级质谱图 Fig.1 MS/MS spectra of NANA in (a) ESI+ and (b) ESI- mode

实验中,采用易挥发的醋酸对血浆和HDL中的NANA进行温和水解。以脂蛋白为例，相同色谱条件下所得峰面积对水解时间作图,如图2所示,水解时间在2 h后,唾液酸并无显著增加。确定最佳的水解条件为pH=2的醋酸在80 ℃下水解2 h。

图2

Fig. 2

图2 醋酸水解HDL中唾液酸的时间效应曲线 Fig.2 Effect of hydrolysis time on the release of sialic acid from HDL

在负离子模式下,NANA的检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为7.4和24.5 pg。采用NANA标准溶液添加法制作的标准曲线为y=347.34x+5 037.6(R²=0.998 1);其中y为峰面积,x为相应进样的质量浓度(ng/mL)。在2.5～80 ng/mL 范围内呈良好的线性关系。加标回收率为98.59%±3.4%(n=6);日内和日间精密度分别为2.16%(n=6)和4.34%(n=6)。

水解后的血浆或脂蛋白样品加入4倍体积的甲醇,经 20 000 g的离心力离心20 min,取上清液。上清液经0.22 μ m过滤器过滤后直接进行LC-MS/MS分析。17例糖尿病患者和19例健康人血浆中平均唾液酸含量分别为(548.3±88.9) mg/L 和(415.3±55.5) mg/L;糖尿病患者的VLDL、LDL和HDL唾液酸的含量依次为(4.91±0.19)、(6.95±0.28)和(3.61±0.22) μ g/mg ;健康人VLDL、LDL和HDL唾液酸的含量依次为(2.90±0.27)、(7.03±0.04)和(2.40±0.09) μ g/mg。糖尿病患者血浆中唾液酸含量、VLDL唾液酸含量和HDL唾液酸含量均显著高于健康人(P＜0.01);而糖尿病患者LDL唾液酸含量与健康人相比无显著差异。

氧化应激可导致糖尿病患者体内LDL的去唾液酸化^[12]。为探讨糖尿病患者体内脂蛋白在氧化应激状态下发生去唾液酸化的难易,本文采用H₂O₂处理脂蛋白,同时设立天然抗氧化剂槲皮素保护组。实验结果表明,采用H₂O₂处理LDL后,其唾液酸含量与对照组相比下降了18.2%(P＜0.01);加入槲皮素可显著降低H₂O₂引起的LDL去唾液酸化(P＜0.05)(见图3)。而采用相同浓度的H₂O₂处理HDL,虽然HDL发生了部分去唾液酸化,但与对照组相比,差异不显著(见图3)。这可能是因为HDL中存在对氧磷酶、载脂蛋白apoA-Ⅰ等具有抗氧化功能的蛋白^[13],从而有效降低了H₂O₂对HDL造成的氧化损伤。

图3

Fig. 3

图3 H2O2引起的糖尿病患者脂蛋白去唾液酸化及槲皮素的保护作用 Fig.3 Desialylation of lipoprotein from diabetics induced by H2O2 and the protective effect of Quercetin. * means P＜0.05,compared with blank control; * * means P＜0.01,compared with blank control. n=3.

研究结果显示:H₂O₂可致脂蛋白去唾液酸化,而加入天然抗氧化剂槲皮素保护后,脂蛋白去唾液酸化程度降低;更为重要的是,在同等氧化应激状态下,LDL较HDL更容易发生去唾液酸化。糖尿病患者的LDL比健康人的LDL含有更多的脂肪酸,因而更易于被氧化^[14]。此外,NANA在氧自由基的作用下,自身脱去1位的羧基,产生1分子CO₂^{[15, 16]},这可能是糖尿病患者的LDL中NANA并未显著增高的原因之一。脂蛋白上大约50%的负电荷是由唾液酸提供的,而糖尿病患者脂蛋白唾液酸含量较健康人发生了显著改变,处于寡糖链末端的唾液酸改变会影响脂蛋白的正常生理功能^{[17, 18]}。