色谱  2015, Vol. 33 Issue (1): 22-28   PDF (954 KB)    
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潘智然
梁海龙
梁朝晖
徐文
基于诊断离子策略的超高压液相色谱-线性离子阱-轨道离子阱质谱联用技术解析中药虎杖的化学成分
潘智然1, 梁海龙1, 梁朝晖1, 徐文1,2     
1. 广州中医药大学第二临床医学院, 广东 广州 510006;
2. 广东省中医药科学院, 广东 广州 510006
收稿日期：2014-07-02
基金项目：国家自然科学基金项目(81402887);2012年广州中医药大学优秀青年学者科研基金(No.10);广东省中医药局建设中医药强省科研课题(20121198).
通讯作者：徐文, E-mail：freexuwen@163.com
摘要：建立了基于超高压液相色谱-电喷雾-高分辨质谱联用技术(UHPLC-ESI-HRMS)的中药虎杖化学成分的快速定性分析方法.采用Waters UPLC C18色谱柱,乙腈-甲酸水系统梯度洗脱,采用ESI-LTQ-Orbitrap高分辨杂交质谱技术负离子采集,线性离子阱质谱进行多级质谱碎裂,轨道离子阱高分辨检测,获取多维质谱数据.利用代表性成分的诊断离子进行搜寻,结合质谱偶电子规律、氮规律、不饱和度和同位素峰等信息,参阅文献,总结主要成分的裂解规律,对主要峰进行指认与鉴定.结果显示,整个分析过程在10 min内完成,该方法分离良好,灵敏度高.对虎杖根中的34种成分进行了结构分析,研究从中药虎杖中发现了多种酚酸取代二苯乙烯苷、酚酸取代蒽醌苷和蒽醌硫酸盐衍生物等成分.研究结果表明本方法为虎杖的后续化学成分研究、相关产品的质量控制和药效物质基础的研究提供了一种高效、可靠的检测手段.
关键词： 超高压液相色谱     线性离子阱-轨道离子阱质谱     化学成分     虎杖     中药    
An ultra-high-pressure liquid chromatography/linear ion trap-Orbitrap mass spectrometry method coupled with a diagnostic fragment ions-searching-based strategy for rapid identification and characterization of chemical components in Polygonum cuspidatum
PAN Zhiran1, LIANG Hailong1, LIANG Chaohui1, XU Wen1,2     
1. The Second College of Clinic Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Guangdong Province Institute of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
Received: 2014-07-02
Abstract: A method for qualitative analysis of constituents in Polygonum cuspidatum by ultra-high-pressure liquid chromatography coupled with linear ion trap-Orbitrap mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap MS) has been established. The methanol extract of Polygonum cuspidatum was separated on a Waters UPLC C18 column using acetonitrile-water (containing formic acid) eluting system and detected by LTQ-Orbitrap hybrid mass spectrometer in negative mode. The targeted components were further fragmented in LTQ and high accuracy data were acquired by Orbitrap MS. The summarized fragmentation pathways of typical reference components and a diagnostic fragment ions-searching-based strategy were used for detection and identification of the main phenolic components in Polygonum cuspidatum. Other clues such as nitrogen rule, even electron rule, degree of unsaturation rule and isotopic peak data were included for the structural elucidation as well. The whole analytical procedure was within 10 min and more than 30 components were identified or tentatively identified. This method is helpful for further phytochemical research and quality control on Polygonum cuspidatum and related preparations.
Key words: ultra-high-pressure liquid chromatography (UHPLC)     LTQ-Orbitrap mass spectrometry     chemical components     Polygonum cuspidatum     traditional Chinese medicine    

中药虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)的干燥根茎,具袪风、利湿、破瘀、通经之功效。临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、散瘀定痛等症[1]。化学成分研究表明虎杖富含酚酸类成分,包括蒽醌类、二苯乙烯类和黄酮类等成分。有关虎杖的活性报道则集中在抗氧化、美白肌肤、抗肿瘤、降血脂、雌激素样作用和抗菌作用方面[2, 3]。

近几年来,电喷雾离子源质谱与液相色谱联用技术已广泛用于中药虎杖及其制剂的体内外分析研究,如董静等[4]利用液相色谱与电喷雾-离子阱-飞行时间质谱(ESI-IT-TOF-MS)联用技术在线鉴定了10种虎杖成分,并对大黄素、大黄素甲醚、虎杖苷等6种对照品在离子阱飞行时间联用质谱中的裂解规律进行了总结。Yi等[5]采用高效液相色谱/电喷雾-质谱的方法鉴别并得到了虎杖中的9个成分。

液相色谱-质谱联用技术具有高效快速、灵敏度高、样品预处理简单等特点,对于含量少、不易分离得到或在分离过程中易丢失的成分能够获取结构信息,特别适用于中药复杂成分的结构分析。目前,对中药化学成分定性研究常用的技术手段包括:(1)通过研究碎片离子,获取多级质谱信息和裂解途径,如离子阱质谱和三重四极杆质谱(QQQ); (2)通过高分辨质谱对母子离子信息进行验证,获取元素组成信息,常见的高分辨质谱有飞行时间质谱、傅里叶变换离子回旋质谱和最近几年发展起来的轨道离子阱(Orbitrap)质谱。随着对中药复杂体系分析要求的不断提升,将多级质谱和高分辨质谱结合起来用于分析中药成分及代谢成分的结构信息已逐渐成为主流,由线性离子阱(LTQ)与轨道离子阱组成的杂交质谱仪(LTQ-Orbitrap hybrid mass spectrometer)是近几年发展起来的一项新技术,其将线性离子阱的高灵敏度、多级质谱功能和Orbitrap超高分辨能力质谱结合起来,可同时实现多级质谱碎裂和母、子离子的高分辨采集,为小分子药物及大分子蛋白质的鉴定与分析提供了更多、更准确的信息[6, 7, 8]。本研究将其与超高压液相色谱结合用于虎杖药材复杂体系中的成分鉴定与分析,为研究虎杖酚类及其他微量成分提供了分析方法基础。

1 实验部分
1.1 仪器与材料

Accela超高压液相色谱仪,包括四元高压泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器(DAD),通过电喷雾离子源与LTQ Orbitrap XL质谱仪连接。数据采集和处理软件为Xcalibur 2.3,质谱裂解规律模拟软件为Mass Frontier，均为ThermoFisher(USA)产品。

HPLC级甲醇、乙腈和甲酸(Thermo-Fisher),流动相用水为Millipore超纯水(18.2 M Ω ·cm,Millipore,USA)。大黄素、大黄素甲醚、虎杖苷于中国药品生物制品检定所购得,大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、没食子酸和白藜芦醇由本实验室经分离纯化获得,其纯度均大于95% 。虎杖药材产自康美药业(lot: 1401000081),购自广东省中医院药房,经广东省中医院黄志海主任药师鉴定为蓼科植物虎杖的干燥根。

1.2 样品制备

称取虎杖药材粉末0.6 g (过60目筛),置于25 mL棕色容量瓶内,加入70%甲醇水溶液20 mL,超声振荡提取30 min,冷却至室温后,加70%甲醇水溶液至刻度,漩涡混匀。取1 mL过0.22 μ m微孔滤膜,冷藏待用。另分别称取各对照品1 mg于5 mL容量瓶中,用70%甲醇定容,过0.22 μ m微孔滤膜,冷藏待用。

1.3 实验条件

色谱条件:色谱柱为Waters UPLCTM Acquity BEH C18 (50 mm×2.1 mm,1.7 μ m);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)系统梯度洗脱,洗脱梯度:0～3.5 min (7%A～12%A),3.5～6 min (12%A～30%A),6～8.5 min (30%A～85%A),8.5～9 min (85%A～90%A);流速为500 μ L/min;进样量为2 μ L;柱温箱设为室温。

离子源参数设置如下:鞘气(sheath gas) 35.5单位;辅助气(auxiliary gas) 2单位;喷雾电压(spray voltage) 3.8 kV;毛细管温度(capillary temp) 320 ℃;管透镜电压(tube lens) -130 V;毛细管电压(capillary voltage) -42 V。在负离子模式m/z 150～1000 范围内采集。一级质谱采用Orbitrap进行高分辨扫描检测,分辨率设为 30000。多级质谱采用动态数据依赖性扫描(data dependent scan),选取上一级最高峰离子进行下级碎裂并进行动态排除,以减少重复扫描。二级质谱采用Orbitrap高分辨检测,分辨率为 15000,三级质谱采用离子阱打拿极(dynode)检测。诱导碰撞解离(CID)碰撞能量设为45% ,其他碰撞参数为默认值。

2 结果与讨论
2.1 LC-MS条件优化

本方法液相色谱分离部分采用超高压液相色谱与小粒径色谱柱(UPLC BEH C18， 1.7 μ m)相结合,配合高流速(500 μ L/min),以达到高效、快速分离的目的。结果表明，整个分析流程在10 min内即可完成(见图1),分析时间大大缩短。

对多种流动相系统进行筛选后发现,乙腈与甲 酸水系统能够获得更好的分离度。同时为了在分离效率和足够宽的单个色谱峰峰宽(以获取较为理想的质谱单循环采集时间点)之间取得平衡,将流动相梯度进行了适当调整,使得大部分目标成分的峰宽在10 s左右。调整后每个目标成分(提取离子)能够获得至少10个采集点,并且通过多级质谱动态排除设置能够对大部分共流出成分获得多级质谱数据。因此整个定性分析只需要采集一次既能获得绝大部分数据,无需多次重复采集。

图1 虎杖提取物LC-MS的总离子流色谱图 Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of extract of Polygonum cuspidatum
2.2 主要化学成分的鉴定

利用上述条件,对虎杖提取液进行UPHLC-LTQ-Orbitrap MS分析,通过对虎杖药材中代表性对照成分的质谱裂解规律进行分析和总结,获取同类型成分共有的子离子信息(诊断离子),对虎杖样品进行初步搜索与归类。实验发现,虎杖中酚酸类成分在负离子模式下容易形成[M-H]-和[M+HCOO]-离子峰,多级质谱容易形成规律性的裂解途径。根据获得的母离子和多级质谱信息和精确相对分子质量信息,对虎杖根中的34种成分进行了分析。表1详细总结了虎杖中主要成分的质谱信息,包括保留时间、高分辨母离子信息、质谱偏差、多级质谱信息及相应的结果。其鉴定过程与结果见下文。

表1 虎杖提取物中主要成分的色谱质谱信息及鉴定结果 Table 1 Identified or tentatively identified components from Polygonum cuspidatum and their LC-MS data
2.2.1 虎杖中二苯乙烯类成分的鉴定

选取虎杖药材中的代表性二苯乙烯类成分虎杖苷对照品进行裂解规律研究。如图2所示,虎杖苷容易形成[M-H]-准分子离子峰,离子阱CID碎裂后表明其裂解途径主要通过糖苷键位置的碎裂重排形成苷元碎片离子m/z 227,苷元进一步裂解分别通过苯环A与苯环B内部发生类似RDA( 反Diels-Alder)重排而形成特征性的m/z 185 (3,5A-离子)、143(2,6A-离子)和159 (1,3B-离子)。同时m/z 183和157离子可认为是苯环的羟基通过重排形成羰基后失去CO中性分子后形成的碎片。

图2 虎杖苷对照品的关键裂解途径 Fig. 2 Key fragmentation pathways of piceid

本研究首先以m/z 227.0713 (C14H11O3)为诊断离子寻找具有相似裂解途径的二苯乙烯成分。其中成分2和成分3均显示相同的准分子离子峰m/z 389.1242 ([M-H]-,C20H21O8)和m/z 435.1298 ([M+COO]-,C21H23O10)。其多级质谱碎片也与虎杖苷一致,表明均为三羟基取代二苯乙烯苷成分,其中成分3与虎杖苷对照品保留时间一致,确定为虎杖苷成分。成分2与虎杖苷有相同的质谱裂解行为,根据已有的文献[9]初步推断成分2为白藜芦醇-O-葡萄糖苷,其糖基的取代位置尚不能确定。

保留时间在2.35 min的成分19形成m/z 227.0713 的[M-H]-准分子离子峰,其二级质谱与虎杖苷的三级质谱完全一致,形成m/z 185、183、159、157等特征离子峰,通过与白藜芦醇对照品进行对照,确定为白藜芦醇。

成分6～9、25和26均具有和虎杖苷相类似的质谱裂解途径,其关键的裂解命名可用图3表示,通过多级质谱信息表明它们均为一系列的酚酸取代的虎杖苷类成分。以成分6～9为例,它们的[M-H]-峰均为m/z 541.1354 (C27H25O12),二级质谱形成m/z 227 (Y0)和m/z 313 (B0)的特征离子,说明葡萄糖单元的某一羟基被取代,B0离子进一步裂解形成m/z 169 (Y1)和m/z 151 (B1离子)。表明可能为取代虎杖苷成分,而通过与虎杖苷的分子式进行比较,推测其可能为没食子酰基,因此初步推测它们均为没食子酰虎杖苷。成分25和26具有相似的裂解途径,形成Y0离子m/z 227和B0离子m/z 307 (或337),进一步裂解分别形成m/z 163的B1离子和m/z 193的Y1离子(图4),初步推测它们分别为水杨酰(或香豆酰)和阿魏酰取代虎杖苷,且为虎杖新的成分。

图3 虎杖二苯乙烯类成分的裂解途径与命名 Fig. 3 Proposed fragmentation pathways of stilbenes in Polygonum cuspidatum and their nomenclatures

图4 推测的化合物25的裂解途径 Fig. 4 Proposed fragmentation pathways of compound 25

除了三羟基二苯乙烯(白藜芦醇)衍生物以外,文献[10]也报道了虎杖中含有四羟基取代二苯乙烯苷成分。本研究通过高分辨质谱检测,确定了2个四羟基取代的二苯乙烯苷成分(成分4与5)的存在,其质谱裂解途径也与何首乌中发现的四羟基取代二苯乙烯苷高度类似[11],形成m/z 243的苷元碎片并进一步裂解成四羟基取代二苯乙烯特征性的离子碎片(m/z 225、215、149和137),由于缺乏相关的文献支持,其取代位置尚不能确定,因此暂定为四羟基取代二苯乙烯苷。

2.2.2 虎杖中蒽醌类成分的鉴定

我们曾对大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素及部分蒽醌苷成分在LTQ-Orbitrap质谱的裂解途径做了详细的报道[11]。通过高分辨质谱数据发现,大部分蒽醌成分容易脱去CO和CO2等中性分子,其中大黄素甲醚的二级质谱因均裂失去6位苯环上\5CH3的自由基,形成一个OE+\5离子的基峰m/z 268,这种均裂的碎裂方式常见于电子轰击离子源质谱,在电喷雾离子源(ESI)等软电离质谱中较少发生,这可能与均裂后形成的自由基能与苯环形成一定的共轭状态有关。之后m/z 268进一步连续脱去酮基上的CO中性分子后形成多个偶数离子。

以大黄素、大黄素甲醚的几个主要子离子m/z 431、269、283、240等作为诊断离子,搜索在虎杖药材LC-MS图谱中潜在的蒽醌类衍生物。其中成分34、18、16的质谱峰经与对照品对比,分别确定为大黄素、大黄素-8-O-葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷。成分17与大黄素-8-O-葡萄糖苷有相同的元素组成和质谱裂解碎片,根据保留行为推断为大黄素-O-葡萄糖苷。同样,成分15初步推断为大黄素甲醚-O-葡萄糖苷,其糖基取代位置尚不可知。

成分23和24的[M-H]-峰均为m/z 583.1086 (C28H23O14),二级质谱形成m/z 269.0449 (C15H9O5)、431.0973 (C21H19O10)和 313.0558 (C13H13O9)。它们的裂解途径可用图5表示,推测为2个大黄素-O-(没食子酰)-葡萄糖苷。成分31 (5.50 min)的准分子离子峰为m/z 517.0985,二级质谱形成m/z 473、431、269等特征离子片段,对m/z 473进行三级碎裂生成m/z 269、311等离子片段。推测为大黄素-O-(丙二酰)-葡萄糖苷成分[12]。采用同样方法,从虎杖中还发现并推测了大黄素甲醚-O-(乙酰基)-葡萄糖苷(成分33)的初步结构。

图5 大黄素-O-(丙二酰)-葡萄糖苷的裂解途径 Fig. 4 Proposed fragmentation pathways of emodin-O-(galloyl)-glucoside

决明酮-8-O-葡萄糖苷广泛存在于虎杖、大黄、首乌等蓼科植物中[13, 14],且含量较高,文献[11]有其质谱规律的相关报道。成分28的高分辨质谱数据与多级质谱裂解途径均与文献11相吻合,可确定其为决明酮-8-O-葡萄糖苷。

在本研究中,利用诊断离子搜寻策略,结合Orbitrap质谱的高分辨和高精度扫描,首次从虎杖中发现了一系列蒽醌硫酸盐类成分,这些成分在LC-MS中的特点主要表现为: (1)保留时间更短(相对原型成分);(2)高分辨质谱推断形成[原型+SO3-H]-的 准分子离子峰;(3)二级质谱容易脱去SO3形成原型成分的碎片离子,MS3则与原型成分的MS2质谱相同或相似。以成分32(7.24 min)为例,其准分子离子峰为失去金属离子后形成的阴性离子m/z 349.0022(C15H9O8S),二级质谱形成m/z 269.0454(C15H9O5)的特征离子基峰,进一步碎裂形成与大黄素相同的特征碎片离子m/z 225、241等,推断其为大黄素硫酸盐成分。我们通过文献搜索发现,Xiao等[15]从虎杖中发现了2个木质素硫酸盐类成分,首次证明了虎杖中酚酸成分硫酸盐衍生物的存在。本文从虎杖中发现较多蒽醌类硫酸盐衍生物如大黄素-葡萄糖苷硫酸盐、大黄素甲醚-葡萄糖苷硫酸盐、决明酮-葡萄糖苷硫酸盐等多种成分。

2.3 讨论

早期文献[16]和《中华本草》报道了虎杖中含有大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚等小分子蒽醌苷元类成分,但本研究中除了大黄素以外,未检测到其他同类小分子蒽醌苷元成分。分析原因可能是该类成分在虎杖中的含量并不高、极性偏低以及在ESI负离子质谱响应不高有关。

本研究中报道了较多蒽醌类硫酸盐衍生物成分且相对离子丰度较高,表明它们具有一定的含量。这些成分的集中出现是否与虎杖药材生长土壤环境或药材采收加工活动相关,值得进一步研究。

3 结论

本研究利用超高压液相色谱-线性离子阱-轨道离子阱高分辨质谱分析了中药虎杖中的多种成分。通过条件优化,虎杖中的酚酸类成分得到较好的分离和质谱响应。实验发现,虎杖中酚酸类成分在负离子模式下容易形成[M-H]-和[M+HCOO]-离子峰。根据获得的母离子和多级质谱信息和精确相对分子质量信息,以白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚等成分的多个诊断离子进行条件搜索,参考已有文献,对虎杖根中的34种成分进行了分析,除已有报道的酚酸类成分外,本研究还发现了多种酚酸取代二苯乙烯苷、酚酸取代蒽醌苷和蒽醌硫酸盐衍生物等成分。本分析方法和研究策略为虎杖的后续化学成分研究、相关产品的质量控制和药效物质基础的研究提供了一种高效、可靠的检测手段。

参考文献
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