邻苯二甲酸酯类化合物(phthalate acid esters,缩写PAEs,又称酞酸酯,俗称塑化剂),普遍用于塑料工业中,作为主要的增塑剂和软化剂,其作用是增大塑料的可塑性和韧性,提高塑料强度;塑化剂还普遍用于建筑材料、化妆品、合成橡胶、洗涤剂、润滑油等产品的生产过程中[1, 2, 3]。塑化剂出现在公众视野,源于中国台湾厂商用一种常见的增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)(后又陆续检出其他多种塑化剂)代替价格昂贵的棕榈油配制“起云剂”,产生和乳化剂相似的增稠效果,用于果汁、果酱、饮料等中。PAEs是一种环境激素,可以模拟体内的天然荷尔蒙,干扰正常荷尔蒙的作用,影响身体内最基本的生理调节机能,具有致癌、致畸、致突变性作用,对人体健康构成危害。2011年6月1日卫生部发布公告,邻苯二甲酸酯类物质被确定为违禁添加的非食用物质,禁止在食品中使用。2011年6月3日,国家药监局的一则通知,让公众进一步意识到了塑化剂的威胁。药监局的通知要求,各地暂停生产、销售含“邻苯二甲酸酯”的两种保健食品(协和牌灵芝孢子粉片和美中清素牌的多种氨基酸片)[4]。PAEs主要通过食品包装材料进入食品,而保健酒中的乙醇对PAEs具有很好的溶解性,因此保健酒也存在这类化合物污染的风险[5]。
目前,PAEs的检测方法有紫外分光光度法[6]、荧光定量聚合酶链反应(PCR)法[7]、毛细管电动色谱法(MEEKC)[8]、高效液相色谱法[9]、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[10, 11, 12]、气相色谱法[13]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[14, 15, 16, 17]等。国内对化妆品[2, 15]、食品[14]、水[3, 9, 13]、包装材料[16]和中药制剂[17]等样品中PAEs测定方法的报道较多,但鲜有涉及保健酒中PAEs测定方法的研究。因此,本实验根据GB/T 21911-2008《食品中邻苯二甲酸酯的测定》标准[18]进行方法优化,采用正己烷提取,气相色谱-三重四极杆质谱法检测,建立了保健酒中邻苯二甲酸酯类物质残留的检测方法。该方法具有灵敏、快速、准确、线性范围宽等优点,可满足保健酒中邻苯二甲酸酯类物质的检测需要。
Agilent 7890A GC/7000B QQQ三重四极杆气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司); MassHunter工作站(美国Agilent公司); HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m,美国Agilent公司); MSE125P十万分之一天平(美国Sartorius公司)。
16种邻苯二甲酸类化合物标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司):邻苯二甲酸二甲酯(DMP,纯度99.5% ,批号16174000);邻苯二甲酸二乙酯(DEP,纯度99.5% ,批号16172000);邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP,纯度99.0% ,批号16173500);邻苯二甲酸二丁酯(DBP,纯度99.0% ,批号16171000);邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP,纯度98.0% ,批号16174400);邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP,纯度99.0% ,批号16174700);邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP,纯度99.0% ,批号16171900);邻苯二甲酸二戊酯(DPP,纯度99.0% ,批号16175500);邻苯二甲酸二己酯(DHXP,纯度98.0% ,批号16173200);邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP,纯度98.0% ,批号16168000);邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP,纯度99.5% ,批号16170500);邻苯二甲酸二环己酯(DCHP,纯度99.9% ,批号16171500);DEHP(纯度98.5% ,批号16173000);邻苯二甲酸二苯酯(DPHP,纯度99.9% ,批号16176000);邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP,纯度99.5% ,批号16175000);邻苯二甲酸二壬酯(DNP,纯度98.5% ,批号16174800)。
3个品牌的正己烷(色谱纯)分别购自德国Merck公司、美国Sigma公司及瑞典Oceanpak公司。
实验样品来自2013年保健食品安全风险监测抽样。
色谱柱:HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);进样口温度:250 ℃;程序升温:初始柱温60 ℃,保持1 min,以20 ℃/min 升温至220 ℃,维持1 min,再以5 ℃/min 升温至300 ℃,维持4 min;载气:氦气(纯度≥99.999% ),流速1 mL/min;进样方式:不分流进样;进样量:1 μ L;色谱与质谱接口温度:280 ℃;电离方式:电子轰击(EI)源;监测方式:选择离子监测(SIM),监测离子见表1;电离能量:70 eV;溶剂延迟:5 min。
标准储备液：取上述16种PAEs标准品20~30 mg，精密称定，分别置于20 mL容量瓶中，用正己烷配制成质量浓度为1~1.5 g/L的单标准储备液，精密量取各单标准储备液2.0 mL至同一100 mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度，配制成各PAEs质量浓度范围为20~30 mg/L的混合标准储备液，于4 ℃冰箱中避光保存；标准使用液：精密吸取上述混合标准储备液0.25、0.5、1.5、2.5、5.0、10.0 mL，分别加正己烷稀释并定容至20 mL，得到质量浓度范围为0.25~15.0 mg/L的PAEs系列浓度混合标准溶液待用。
精密量取混合均匀的液体试样5.0 mL,置于25 mL梨形分液漏斗中,精密加入正己烷5.0 mL,振摇30 s,静置分层,重复提取4次,取第4次提取的上清液,即得。除DIBP、DBP保留时间处有干扰峰外,空白溶液在其他14种PAEs标准品特征离子质量色谱峰相同保留时间处无干扰峰(见图1)。在计算含量时,需扣除空白干扰。
精密量取混合均匀的液体试样5.0 mL,置于25 mL梨形分液漏斗中,精密加入正己烷5.0 mL,振摇30 s,静置分层,提取一次,取上清液,进行GC-QQQ-MS测定。根据选择的保留时间和定性离子的丰度比值进行定性确证:试样待测液和标准品的选择离子色谱峰在相同保留时间处(±0.5% )出现,并且对应的离子的质荷比(m/z)与标准品一致,其相对丰度比与标准品相比应符合以下4个条件:相对丰度＞50%时,允许±10%偏差;相对丰度为20% ～50%时,允许±15%偏差;相对丰度为10%~20%时，允许±20%偏差；相对丰度≤10%时,允许±50% 偏差;此时可定性确证目标化合物。被判为阳性样品的,提取定量离子,采用外标标准曲线法定量分析:以各PAEs的标准溶液质量浓度为横坐标,各自的定量离子的峰面积为纵坐标,作标准曲线线性回归方程,以试样的峰面积与标准曲线比较定量。
采用全扫描模式对16种目标组分标样进行测定,根据各目标组分的质谱图,选择4个特征离子作为其定性分析的质谱条件(见表1),根据保留时间和碎片离子丰度比值判断定性结果,同时确定了各邻苯二甲酸酯类物质的定量离子,根据定量离子质量色谱峰峰面积与质量浓度标准曲线法定量。图2为同一浓度的16种PAEs标准品的全扫描模式(Full scan)和SIM的总离子流图(TIC)。由图2可知,采用SIM较全扫描模式可使目标组分的检测灵敏度得到提高,且消除了基质干扰。
保健酒中含有30% ～60%的乙醇,由于乙醇对PAEs的溶解性很好,因此按照GB/T 21911-2008《食品中邻苯二甲酸酯的测定》检测方法,使用2.0 mL正己烷萃取保健酒中的PAEs时效果较差。采用先除去保健酒中的乙醇后再用正己烷提取分析测定,实验发现,由于保健酒中含有植物、动物提取物,水浴蒸掉乙醇后,溶液黏稠、凝固,很难用正己烷将塑化剂提取出来,且塑化剂在加热过程中会损失。因此,考虑增加提取溶剂正己烷的量,以提高提取效率。实验发现,取5.0 mL保健酒,分别用5.0 mL正己烷提取3次,可以提取完全,合并3次提取液,水浴浓缩至近干,加入2.0 mL正己烷溶出,测定发现:在加热过程中,DMP和DEP挥发损失严重。因此,采用不除去乙醇、不浓缩正己烷,用正己烷直接提取一次的方法处理样品,对提取溶剂的体积进行优化。准确量取5.0 mL未检出PAEs的阴性保健酒样品,添加PAEs系列浓度混合标准溶液第4个浓度点的混合标准溶液,平行4份,分别采用2.0 mL和5.0 mL正己烷提取,试验结果见表2,采用5.0 mL正己烷提取一次后得到较好的回收率。
精密量取未检出邻苯二甲酸酯类物质的阴性样品5份,每份5.0 mL,置于25 mL梨形分液漏斗中,分别精密加入 PAEs系列浓度混合标准溶液中第2~6个浓度点(PAEs质量浓度范围约为0.50~15.0 mg/L)的混合标准溶液各1.0 mL，再精密加入正己烷4.0 mL，振摇30 s,静置分层,分取上清液,即得。按上述GC-MS条件进行测定,以各PAEs特征离子质量色谱峰峰面积y对其在样品中的质量浓度x作标准曲线，结果见表3。
精密量取未检出PAEs的阴性样品5.0 mL,置于25 mL梨形分液漏斗中,精密加入PAEs系列浓度混合标准溶液第4个浓度点(PAEs的质量浓度范围为2.54~3.84 mg/L)的混合标准溶液1.0 mL，再精密加入正己烷4.0 mL,振摇30 s,静置分层,分取上清液,按上述GC-MS条件进行测定,连续进样6次,记录各PAEs的峰面积,RSD≤3.8% ,结果表明精密度良好(见表4)。
精密量取未检出邻苯二甲酸酯类物质的阴性样品5.0 mL,置于25 mL梨形分液漏斗中,精密加入 PAEs系列浓度混合标准溶液中最低浓度点(PAEs的质量浓度范围为0.25~0.38 mg/L)的混合标准溶液1.0 mL，再精密加入正己烷4.0 mL,振摇30 s,静置分层,分取上清液进行GC-MS分析,依据特征离子质量色谱峰信噪比为3和10计算DMP、DEP、DIBP、DBP、DMEP、BMPP、DEEP、DPP、DHXP、BBP、DBEP、DCHP、DEHP、DPHP、DNOP、DNP的检出限和定量限(见表4)。
取未检出邻苯二甲酸酯类物质的阴性样品9份,每份5.0 mL,置于25 mL梨形分液漏斗中,分别精密加入PAEs系列浓度混合标准溶液中第1、2、4浓度点(PAEs的质量浓度范围分别为0.25~0.38 mg/L、0.51~0.77 mg/L、2.54~3.84 mg/L)的低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液各1.0 mL，每个水平制备3份,再精密加入正己烷4.0 mL,振摇30 s,静置分层,分取上清液,作为回收率供试溶液备用。分别精密量取上述3个浓度 点的PAEs系列浓度混合标准溶液各1.0 mL， 置于25 mL具塞比色管中,每个质量浓度水平制备3份,再精密加入正己烷4.0 mL,混匀,作为回收率对照溶液备用。按上述GC-MS条件进行测定,每份样品进样两次,记录16种邻苯二甲酸酯类物质的特征离子质量色谱峰峰面积,计算回收率(见表5)。
取81批保健酒,按1.5节方法处理试样,按1.2节GC-MS条件测定,结果见表6。典型的样品图谱见图3。
样品测定结果表明,DMP、DIBP、DBP在保健酒中普遍存在,DIBP和DBP含量较高。GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》[19]规定了DMP、DIBP、DBP的最大残留量分别为3.0、10.0、0.3 mg/kg。有19批样品中DBP的含量超过规定,含量最高的样品中DBP达2.27 mg/L,超标657% 。
由于塑化剂存在于环境和所使用的器皿、试剂中,因此,所有使用的玻璃器皿在使用前需经重铬酸钾浸泡过夜,超纯水清洗,正己烷润洗,再在烘箱中200 ℃下烘3 h之后使用;定量容器用正己烷润洗后自然晾干,实验过程中避免与塑料接触。实验中发现,不同品牌的正己烷中存在不同种类和含量的塑化剂,对样品测定存在干扰。因此,筛选了不同品牌的正己烷,实验结果表明:Sigma、OCEANPAK公司的正己烷在与16种PAEs对照品特征离子质量色谱峰相同保留时间处干扰峰最少(只有DIBP,DBP干扰),其峰强度小于检出限,计算含量时可扣除空白干扰。
卫生部办公厅关于通报食品及食品添加剂中邻苯二甲酸酯类物质最大残留量的函(卫办监督函[2011]551号)中规定食品、食品添加剂中的DEHP和DBP的最大残留量分别是1.5 mg/kg 和0.3 mg/kg[20],如何判定PAEs是在食品中故意违法添加的还是从食品包装材料中合法迁移的,以及PAEs在保健品中的限值应该如何判定,是否可以参照食品标准,这是目前亟待解决的问题。
本文采用正己烷振摇提取作为前处理方法，操作简便、重现性好、试剂消耗量较少。应用GC-QQQ-MS同时测定保健酒中16种邻苯二甲酸酯类化合物的残留量，可消除基质对目标组分的干扰，测定结果准确性好，灵敏度高。对市售81批样品的检测结果进行了分析，建议酒类制品的包装材料不宜使用聚乙烯、聚丙烯等塑料制品，以消除潜在的安全隐患。酒类制品中邻苯二甲酸酯类物质的残留量的测定可以借鉴本研究建立的方法。
2014, Vol. 32 Issue (11): 1286-1292
PDF (883 KB)
2014, Vol. 32 Issue (11): 1286-1292
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