色谱  2014, Vol. 32 Issue (11): 1275-1279   PDF (848 KB)    
扩展功能
加入收藏夹
复制引文信息
加入引用管理器
Email Alert
RSS
本文作者相关文章
山广志
宗艳平
王晓
卢静华
离子色谱法测定三磷酸腺苷二钠制剂中主成分及有关物质的含量
山广志1 , 宗艳平1,3, 王晓2, 卢静华3    
1. 中国医学科学院医药生物技术研究所, 北京 100050;
2. 烟台东诚药业集团股份有限公司, 山东 烟台 264006;
3. 辽宁医学院药学院, 辽宁 锦州 121000
收稿日期：2014-7-4
基金项目：科技部新药创制重大专项平台项目(2012ZX09301002-001-019).
通讯作者：山广志,E-mail:Shanguangzhi@imb.pumc.edu.cn.
摘要：建立了用于三磷酸腺苷二钠制剂中主成分及有关物质含量测定的离子色谱方法。采用IonPac AS11-HC色谱柱,以KOH溶液为淋洗液,梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,进样10 μL,以Dionex AERS 500 4-mm抑制器的电导检测器检测,三磷酸腺苷二钠(ATP-Na2)的含量按峰面积以外标法计算,二磷酸腺苷二钠(ADP-Na2)及单磷酸腺苷二钠(AMP-Na2)按加校正因子的主成分自身对照法计算,未知杂质按主成分自身对照法计算。ATP-Na2、ADP-Na2及AMP-Na2的线性范围分别为0.000146~1.83 g/L、0.000484~1.51 g/L及0.000426~0.804 g/L,相关系数分别为0.9997、0.9996及0.9999;对照品溶液在24 h内的稳定性良好(峰面积RSD分别为1.3%、1.4%、2.5%);ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2的方法定量限(S/N=10)分别为1.5 ng、4.8 ng、4.3 ng,检出限(S/N=3)分别为0.58 ng、1.21 ng、1.28 ng;ATP-Na2在3个水平的加样回收率分别为96.50%、96.57%和96.77%。本方法适用于三磷酸腺苷二钠制剂的质量控制。
关键词： 离子色谱法     电导检测器     三磷酸腺苷二钠     有关物质     制剂    
Determination of principal components and related substances in adenosine disodium triphosphate preparation by ion chromatography
SHAN Guangzhi1 , ZONG Yanping1,3, WANG Xiao2, LU Jinghua3    
1. Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China;
2. Yantai Dongcheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Yantai 264006, China;
3. College of Medicine, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, China
Received: 2014-7-4
Abstract: A new method was developed for the determination of adenosine disodium triphosphate (ATP-Na2) and its related substances in ATP-Na2 preparation by ion chromatography (IC). The sample was diluted with ultrapure water and filtrated by 0.22 μm polyether sulfone filter membrance, and then analyzed by IC directly without any more pretreatment. The analysis was performed on a Dionex IonPac AS11-HC column(250 mm×4 mm) and a guard column IonPac AG11-HC (50 mm×4 mm). A KOH eluent generator cartridge was used for gradient elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection was performed by a Dionex suppressed (Dionex AERS 500 4-mm) conductivity detector. The injection volume was 10 μL. The assay was quantitatively completed by external standard method and the related substances were calculated with correction factors. The linear ranges of the method for ATP-Na2, adenosine disodium diphosphate (ADP-Na2) and adenosine disodium monophosphate (AMP-Na2) were 0.000146-1.83 g/L (r=0.9997), 0.000484-1.51 g/L (r=0.9996) and 0.000426-0.804 g/L (r=0.9999), respectively. The average recoveries of ATP-Na2 were 96.50%, 96.57% and 96.77% at three spiked levels. The limits of quantitation (S/N=10) of ATP-Na2, ADP-Na2 and AMP-Na2 were 1.5 ng, 4.8 ng, 4.3 ng, and the limits of detection (S/N=3) were 0.58 ng, 1.21 ng, 1.28 ng, respectively. The results demonstrated that the system has the advantages of high sensitivity, facile automation and simple sample pretreatment. The method is suitable for the quality control of adenosine disodium triphosphate preparations.
Key words: ion chromatography (IC)     conductivity detector     adenosine disodium triphosphate (ATP-Na2)     related substances     preparation    

三磷酸腺苷(ATP)作为一种辅酶,有改善机体代谢的作用,参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸以及核苷酸的代谢,能够调节神经传递、肌肉收缩以及血流量等[1],同时又是体内能量的主要来源。三磷酸腺苷二钠(adenosine disodium triphosphate,ATP-Na2)的制剂形式主要有注射剂和片剂两种,临床上用于进行性心肌萎缩、心肌疾患、心功能不全[2]、脑出血后遗症及肝炎[3]等疾病的辅助治疗。

ATP中的高能磷酸键不稳定,目前已知主要降解产物为一磷酸腺苷(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)二钠盐。国家标准中ATP-Na2及有关物质的含量测定方法为重量比法[4, 5, 6, 7],采用紫外E值法计算总核苷酸量,再利用HPLC计算ATP、ADP、AMP面积比,进而折算三者含量。总核苷酸量的测定极易受辅料和包衣材料的干扰[8]。有文献采用纸电泳法[9]和毛细管区带电泳法[10]检测ATP-Na2,前者经纸电泳法分离后,再用紫外分光光度法测定,整个实验操作过程较繁琐,结果重现性差;后者的缓冲液配制较为复杂(需精确的pH值)。近年来有文献[11, 12, 13]采用离子对试剂的方法利用HPLC紫外检测对ATP-Na2及有关物质进行检测。上述方法均基于样品的紫外吸收,采用特定波长对主成分及ADP、AMP进行检测,检出成分缺乏全面性,难以全面而真实地反映制剂的组成和成分。

离子色谱法(IC)具有流动相简单,灵敏度高,环保无污染等特点,采用在线淋洗液发生器后,大大简化了流动相配制操作,并增强了方法重现性,适用于阴离子药物的分离与检测[14, 15, 16, 17, 18]。本文采用KOH溶液梯度洗脱建立了ATP-Na2注射液含量测定和有关物质检查的方法，经方法学验证,该方法重复性好,专属性和耐用性强,适用于ATP-Na2的质量分析和控制。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Thermo Dionex ICS-5000+型离子色谱仪(电导检测器,Dionex AERS 500 4-mm抑制器,淋洗液自动发生器(EGC-500),Chromeleon 7.2色谱工作站)(ThermoFisher公司,美国);天平(XP205,METTLER TOLEDO公司,瑞士); Milli-Q超纯水器(Integral 10,Merck Millipore公司,德国);水相针式过滤器(聚醚砜,批号9G020320,上海安普科学仪器有限公司,中国)。

ATP-Na2对照品:批号MKBQ5248V,HPLC纯度99.5% ,水分2.6%; ADP-Na2对照品:批号SLBB1854V,HPLC纯度99% ,水分7% ; AMP-Na2对照品:批号WXBB0607V,HPLC纯度99% ,水分17%(Sigma公司)。水为超纯水(电阻率大于18.2 M Ω \5cm)。

ATP-Na2注射液,批号1309152、13021342,规格为2 mL/20 mg; ATP-Na2片,批号131101、130832,规格20 mg/片,均为市售制剂。

1.2 溶液制备

对照品溶液:精密称取ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2对照品适量,分别用超纯水制成每1.0 mL中约含1.0 mg的对照品溶液,摇匀,即得。

供试品溶液:取供试品适量,加超纯水定量稀释成每1 mL中约含1.0 mg的溶液,摇匀,即得。

有关物质检查对照溶液:将供试品溶液稀释100倍作为有关物质检查对照溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱:分析柱Thermo Dionex IonPacTMAS11-HC(250 mm×4 mm);保护柱Thermo Dionex IonPacTMAG11-HC(50 mm×4 mm);淋洗条件:带连续再生阴离子捕获柱(CR-TC)装置的淋洗液自动发生器(EGC-500)产生KOH,梯度淋洗程序见表1;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μ L;检测方式:抑制性电导检测,采用自循环模式的阴离子电解再生抑制器,抑制电流223 mA。

表1 梯度淋洗程序 Table 1 Gradient elution program
2 结果与讨论
2.1 检测器的选择

方法建立过程中考察了相同样品浓度下紫外(UV)、积分安培(ED)和电导(CD)检测器的使用情况,结果发现3种检测器在有关物质检测方面有较大差异:IC-UV由于采用特定波长检测,与离子对HPLC-UV条件下的结果相似,仅能检出AMP、ADP、ATP和部分未知杂质,对产品中可能存在的其他离子无响应,且UV并非IC的标准检测器,故未采用UV检测器；积分安培检测器常用于分析解离度低,电导检测器难于检测或根本无法检测的pK＞7的离子[19],并且ED的样品承载量较小,试验中发现1.0 g/L 质量浓度下ATP峰会因过载出现分叉,而降低浓度后部分微量杂质峰难以检测,导致检测范围狭窄,且对部分成分无响应。本品解离度较好,用电导检测器能够获得较好的检测效果,故未采用ED进行检测。

本实验采用的电导检测器,既能够满足ATP及其主要降解杂质ADP和AMP的检测,还可对制剂中的其他阴离子物质及辅料等(PO3-4、EDTA、Cl-、CO2-3、SO2-3、SO2-4)进行检测,在满足主成分和已知杂质控制的前提下,检出的成分更全面,灵敏度也能满足检测的要求,故最终选用电导检测器进行三磷酸腺苷二钠制剂中有关物质的考察(见图1),以求更全面地反映该药物的质量状况。

图1 ATP-Na2的离子色谱图 Fig.1 Ion chromatograms of ATP-Na2 a. blank solution; b. ATP-Na2，ADP-Na2，AMP-Na2 mixed reference substance solution (ATP-Na2 1.0 g/L,ADP-Na2 0.6 g/L,AMP-Na2 0.5 g/L); c. sample solution: injection; d. sample solution: tablets.
1. ATP; 2. ADP; 3. AMP; 4. PO3-4; 5. EDTA; 6. Cl-; 7. CO2-3; 8. SO2-3; 9. SO2-4.
2.2 响应因子的测定

电导检测器的响应信号与待测成分带电情况(电荷数)、摩尔质量、解离度等均相关[19],为了减少对照品的使用,本方法测定了ATP-Na2与其主要降解产物AMP-Na2和ADP-Na2之间的响应因子,结果见表2。可以看出在该色谱条件下ADP-Na2相对ATP-Na2的响应因子为 0.747 1,AMP-Na2相对ATP-Na2的响应因子为 0.481 7,因此对已知主要降解杂质AMP和ADP采用加校正因子的主成分自身对照法较为合适。

表2 ADP-Na2、AMP-Na2相对ATP-Na2的响应因子 Table 2 Response factors of ADP-Na2 and AMP-Na2 relative to ATP-Na2
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适用性试验

理论塔板数按ATP计不低于 50 000,ATP与其相邻色谱峰之间的分离度均大于2.0,供试品溶液稀释 1 000 倍仍可检出ATP。

2.3.2 专属性试验

取供试品(批号1309152)适量(约相当于 ATP-Na2 10.0 mg),分别加入30%(质量分数)过氧化氢溶液1.0 mL、1 mol/L 盐酸溶液1.0 mL、1 mol/L 氢氧化钠溶液1.0 mL,室温放置1 h后中和;另取样品分别置于100 ℃烘箱中加热1 h和强光下照射24 h。上述样品分别加水稀释至10 mL,进样检测。结果表明,在该色谱条件下,本品经强酸、强碱、氧化、高温和光照破坏后,杂质峰面积增加,同时主峰后存在未知杂质峰;所有杂质峰均能与主峰完全分离,表明本方法专属性良好。

2.3.3 线性关系

精密称取ATP-Na2对照品45.7 mg,逐级稀释至质量浓度分别为1.83、0.914、0.366、0.183、0.073 1、0.014 6、0.003 66、0.000 146 g/L 的系列对照品溶液;精密称取ADP-Na2对照品37.8 mg,逐级稀释至质量浓度分别为1.51、0.756、0.302、0.060 5、0.012 1、0.002 42、0.000 484 g/L 的系列对照品溶液;精密称取AMP-Na2对照品40.2 mg,逐级稀释至质量浓度分别为0.804、0.402、0.161、0.032 2、0.006 43、0.001 29、0.000 426 g/L 的系列对照品溶液。在1.3节色谱条件下进样,记录色谱图。以样品质量浓度(C,g/L)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,分别拟合回归方程并计算相关系数,结果见表3,本色谱条件下ATP-Na2、ADP-Na2和AMP-Na2的线性良好。

表3 待测离子的线性关系及LOQ和LOD Table 3 Linear relationships,LOQs and LODs of the ions
2.3.4 定量限及检出限

定义S/N=3时的质量浓度为检出限(LOD),S/N=10时的质量浓度为定量限(LOQ),ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2的检出限和定量限结果见表3。

2.3.5 精密度、重复性和稳定性试验

取1.0 g/L的ATP-Na2对照品溶液,连续进样6次,其峰面积的RSD为0.57% ,表明本方法精密度良好。

取批号为1309152的样品,平行制备6份1.0 g/L的溶液,进样检测,ATP-Na2平均含量为105.6% ,RSD为0.32% ,表明本方法重复性良好。

取ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2对照品溶液,在室温下放置0、3、6、9、12、24 h后分别进样,结果峰面积的RSD分别为1.3% 、1.4% 、2.5%(n=6),表明对照品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.3.6 回收率试验

精密量取1.0 mL(10 g/L)的供试品(批号1309152)9份,分别置于25 mL的容量瓶中,加入精密称取的ATP-Na2对照品约10.0、15.0、20.0 mg各3份,用超纯水稀释至刻度,制成质量浓度约为0.8、1.0、1.2 g/L 的溶液,分别进样,结果见表4。

表4 注射液中ATP-Na2的加标回收率和相对标准偏差 Table 4 Recoveries and RSDs of ATP-Na2 in injection
2.3.7 方法耐用性

取供试品(批号1309152)在不同流速(±10% )、柱温(±5 ℃)等色谱条件下测定,各条件下主峰的理论塔板数均大于 50 000,主峰与相邻杂质峰分离度大于3.8,主成分平均含量为105.4% ,RSD为0.51%(n=6),表明本方法耐用性良好。

2.3.8 样品测定

取4批市售样品,按1.2节下方法制备供试品溶液和有关物质检查对照溶液。按1.3节条件进样测定,按外标法计算主成分含量,按加校正因子的主成分自身对照法计算ADP-Na2和AMP-Na2含量，结果见表5。

表5 注射液及片剂中ATP-Na2及其有关物质含量的测定结果 Table 5 Contents of ATP-Na2 and related substances in injections and tablets
3 结论

本文建立了测定ATP-Na2注射液中主成分及有关物质含量的离子色谱法,采用外标法进行含量测定,利用加校正因子的主成分自身对照法进行已知降解产物ADP-Na2和AMP-Na2的定量,方法简便易行,绿色无污染。方法学验证结果显示该方法重现性好,灵敏度能够满足ATP制剂中杂质的检测要求,结果准确。

本方法显示了较强的分离能力,除了能够对主成分及其杂质进行检测以外,还能够完成对部分辅料的检测,能全面和有效地反映和控制三磷酸腺苷产品的质量,可为生产企业开展质量控制提供依据和借鉴。

参考文献
[1]Jager R, Roberts M D, Lowery R P, et al. J Int Soc Sport Nutr, 2014, 11(1): 28  
[2]Li Y F, Dong N, Cheng X D, et al. Journal of Clinical Emergency Call (李运峰, 董宁, 程向东, 等. 临床急诊杂志), 2004, 5(3): 4
[3]Yi S Y, Zhi D S. Diagnosis and Treatment of Traumatic Brain Injury. Beijing: People's Medical Publishing House (易生禹, 只达石. 颅脑损伤诊治. 北京: 人民卫生出版社), 2000: 110
[4]Pharmacopoeia Commission of People's Republic of China. Pharmacopoeia of People's Republic of China, Part 2. Beijing: China Medical Science and Technology Press (国家药典委员会. 中华人民共和国药典, 二部. 北京: 中国医药科技出版社), 2010: 28
[5]Pharmacopoeia Commission of People's Republic of China. The First Addendum of Pharmacopoeia of People's Republic of China. Beijing: China Medical Science and Technology Press (国家药典委员会. 中华人民共和国药典第一增补本. 北京: 中国医药科技出版社), 2010: 313
[6]The Quality Standards for Drug of China, National Drug Standard Provincial Standard of Chemical Drug Up to National Standard. Vol. 9 (国家药品标准, 化学药品地方标准上升国家标准. 第9册). 2002: 9.[2014-07-04]. http://db.yaozh.com/content.php?action=biaozhun&uid=41360
[7]State Food and Drug Administration Standards (国家食品药品监督管理局标准). YBH22872005.[2014-07-04]. http://db.yaozh.com/biaozhun/huayaobz1-16/ws-10001-(HD-0787)-2002.htm
[8]Mo Z L. Strait Pharmaceutical Journal (莫姿丽. 海峡药学), 2011, 23(9): 75
[9]Drug Standard of Ministry of Public Health[Two Sixth Volumes (Biochemical Medicine Article)] (卫生部药品标准[二部第六册(生化药品第一分册)]), 1998. [2014-07-04]. http://db.yaozh.com/content.php?action=biaozhun&uid=18243
[10]Wang X Y, Lin Y. Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics (王学艳, 林英. 中国生化药物杂志), 2001, 22(3): 151
[11]Hao S L, Xu K S. Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics (郝苏丽, 徐康森. 中国生化药物杂志), 2001, 22(6): 305
[12]Chen Q H, Li P, Zhu J. China Pharmaceuticals (陈琴华, 李鹏, 朱军. 中国药业), 2013, 22(18): 22
[13]Zhao L, Sheng B Y. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy (赵岚, 盛炳义. 中国现代应用药学), 2002, 19(5): 403
[14]Chen Y, Liu Y X, Chen Z D, et al.Chinese Journal of Chromatography (陈郁, 刘玉秀, 陈智栋, 等. 色谱), 2012, 30(4): 414
[15]Hu Z Y, Ye M L, Pan G W, et al. Chinese Journal of Chromatography (胡忠阳, 叶明立, 潘广文, 等. 色谱), 2012, 30(4): 391
[16]Zhang T T, Wang N N, Ye M L, et al.Chinese Journal of Chromatography (张婷婷, 王娜妮, 叶明立, 等. 色谱), 2013, 31(1): 88
[17]Lin L, Wang H B, Shi Y L. Chinese Journal of Chromatography (林立, 王海波, 史亚利. 色谱), 2013, 31(3): 281  
[18]Wang Y, Geng Q, Zuo Y X, et al. Chinese Journal of Chromatography (王勇, 耿庆, 左跃先, 等. 色谱), 2013, 31(9): 920
[19]Mou S F, Liu K N, Ding X J. Ion Chromatographic Method and Its Application. 2nd ed. Beijing: Chemical Industry Press (牟世芬, 刘克纳, 丁晓静. 离子色谱方法及应用. 2版. 北京: 化学工业出版社), 2005: 135