由于蛋白质、生物酶、核糖核酸等本身都具有手性,当手性药物进入生物体后,与生物大分子之间产生严格的立体结构匹配,从而导致药物对映体显示出不同的药理和毒理作用。 β -受体阻滞剂是一类临床广泛使用的手性药物,常用于治疗高血压、心绞痛及心律失常等疾病[1]。如阿替洛尔的S-对映体具有降血压和心动过缓的药效,而R-对映体则无此效果[2]。Giachetti等[3]和Biswas等[4]还分别发现阿替洛尔对映体在体内的药代动力学和毒性也存在较大的差异。因此发展这类药物的对映体快速拆分新方法,对深入研究药物的作用机理、毒性、代谢,乃至药物生产过程中的质量控制都有十分重要的意义。
阿替洛尔(氨酰心安,atenolol)属于含氨基丙醇类结构的手性药物,结构见图1。其对映体拆分方法主要有诱导结晶拆分法、化学拆分法、膜拆分法、酶拆分法、色谱拆分法和毛细管电泳拆分法等[5, 6, 7, 8]。初永宝等[8]以甲酰胺为介质,柠檬酸-三羟甲基氨基甲烷为电解质,采用非水毛细管电泳法成功地拆分了阿替洛尔等9种手性药物,其中阿替洛尔对映体的拆分时间为50 min。手性高效液相色谱法对测定药物的立体化学差异性具有更好的适用性,除此之外,它也是制备光学纯手性药物的有效工具。Bhushan等[9]以三聚氰氯为手性衍生剂,在C18液相色谱柱上间接地拆分了阿替洛尔等4种 β -受体阻滞剂药物。周采菊等[10]采用磺丁基醚 β -环糊精流动相添加剂法,在Kromasil C18柱上拆分了阿替洛尔对映体。目前采用固定相直接拆分的应用较普遍。Agustian等[11]采用Chiralcel OD-H纤维素手性柱,以正己烷-异丙醇-二乙胺为流动相,在正相色谱条件下拆分了阿替洛尔对映体,并考察了不同溶剂溶解阿替洛尔对分离的影响。张娟红等[12]也采用Chiralcel OD-H柱,以含0.2%(v/v)氨水正己烷溶液和乙醇/异丙醇/氨水(90 ∶ 10 ∶ 0.2,v/v/v)混合溶液分别为流动相A和B,发展了一种LC-MS-MS拆分和检测普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔和比索洛尔对映体的方法。Mikuldas等[13]采用Chiralpak AD直链淀粉手性柱,以正己烷-乙醇为流动相,研究了单一阿替洛尔对映体的液相色谱制备方法。EI Deeb[14]采用Chirobiotic V2万古霉素柱,以乙腈-甲醇-醋酸-三乙胺为流动相,拆分了阿替洛尔对映体,分析时间约40 min。Wang等[15]制备了全苯氨基甲酸酯化 β -环糊精柱,拆分了普萘洛尔等4种 β -阻滞剂对映体,但不包括阿替洛尔。
最近,我们实验室制备了一种二硝基苯醚化 β -环糊精键合有序介孔SBA-15手性固定相(NESP),报道了其制备方法和基本手性分离性能的评价[16],其结构见图1。本文采用这种新型固定相,优化了色谱分离条件,实现了阿替洛尔对映体的快速拆分(约20 min),并建立了一种测定阿替洛尔片剂中对映体含量的新方法。与其他的环糊精手性柱相比,硝基苯醚环糊精配体含稳定的醚键,不易水解;带有吸电子的 π -酸型配体,对碱性药物阿替洛尔对映体有较高的分离选择性;有序的介孔SBA-15基质涡流扩散小、传质快,为药物对映体的快速监测创造了条件。自制的环糊精柱比商品柱便宜得多,可降低测试成本,有良好的应用前景。
日本岛津液相色谱系统包括LC-6A泵、SPD-6AV紫外-可见光检测器,配有Rheodyne 7725手动进样阀及N-2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);元素分析仪(Vario EL Ⅲ,德国Elementar公司);冷场发射扫描电子显微镜(JSM-6701F,日本Jeol公司);电子天平(AR1140,美国Ohaus公司);超纯水制备装置(Milli-Q,美国Millipore公司);数控超声波清洗器(KQ-100E,昆山市超声仪器有限公司)。
有序介孔SBA-15(孔径约25 nm,比表面积420 m2/g)、含炔基的SBA-15和含叠基的2,4-二硝基苯醚化 β -环糊精均为自制[16]。合成实验使用的 β -环糊精、3-氨丙基三乙氧基硅烷、丙炔酸、叠氮化钠、2,4-二硝基氯苯、三嵌段聚合物P123、正硅酸乙酯(TEOS)均购于Sigma公司;1,3,5-三甲苯(TMB)购于阿拉丁试剂上海公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为分析纯,使用前经过氢化钙除水减压重蒸。外消旋的阿替洛尔标准品购于Sigma公司;乙腈和甲醇为色谱淋洗剂(美国Tedia公司);三乙胺(TEA,分析纯,国药集团化学试剂有限公司),用前重蒸一次;冰醋酸(HOAc,分析纯,上海青析化工科技有限公司);水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
4种药片:阿替洛尔片(25 mg/片,批号120801)由浙江万马药业有限公司生产;阿替洛尔片(50 mg/片,批号110901)由浙江亚太药业有限公司生产;阿替洛尔片(25 mg/片,批号120101)由天津市中央药业有限公司生产;阿替洛尔片(25 mg/片,批号130601)由山东平原制药厂生产。
参照本实验室已报道的制备SBA-15基质和二硝基苯醚化环糊精键合SBA-15手性固定相(NESP)的方法[16]制备。
类球形SBA-15的制备:以P123为模板,TMB为扩孔剂,TEOS为硅源,在酸性条件下TEOS水解,自组装后转入水热反应釜中静态晶化,除模板后得到SBA-15。3个不同批次制备的类球形SBA-15的孔径为20～30 nm,粒径为3～5 μ m,比表面积为350～450 m2/g。采用有序介孔SBA-15为基质制备的色谱柱渗透性好,且有较好的色谱重现性。SBA-15的扫描电镜影像见图2。
NESP固定相的制备:将3.5 g 2,4-二硝基苯醚-叠氮基- β -环糊精溶于50 mL干燥的DMF中,搅拌下加入3.0 g含炔基的SBA-15硅胶,然后加入催化剂CuI(PPh3) (10% ,物质的量分数),在氮气保护下于85 ℃反应72 h,冷至室温,过滤,固体用DMF充分洗涤,然后用10%(v/v)EDTA水溶液氧化和洗涤除去亚铜离子,再用水洗,最后用丙酮索氏提取24 h,真空干燥24 h,得到2,4-二硝基苯醚- β -环糊精手性固定相。
含炔基的SBA-15硅胶的元素分析结果为C: 0.85% ,H: 0.42% ,N: 0.13% ;新制备的NESP为C: 2.96% ,H: 1.12% ,N: 0.43% 。根据NESP的碳含量计算键合量为0.068 μ mol/m2。以丙酮为匀浆剂,甲醇为顶替剂,在恒压(34.5 MPa)下,将手性固定相装填入一根不锈钢色谱柱中(150 mm×4.6 mm)。新柱用甲醇和水反复冲洗,最后用流动相平衡,直至基线稳定后进样分析。
准确称取一定量的外消旋的阿替洛尔标准品,用甲醇溶解,配制成400 μ g/mL 的储备溶液(每种对映体200 μ g/mL),于冰箱中4 ℃避光保存。用流动相稀释至所需浓度,经0.45 μ m滤膜过滤,超声脱气,直接进样分析。流动相为乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺(90 ∶ 10 ∶ 2.5 ∶ 3.0,v/v/v/v),使用前用G4砂芯漏斗过滤,超声脱气。流速为0.5 mL/min;柱温为20 ℃;进样量为20 μ L;检测波长为275 nm。死时间由1,3,5-三叔丁基苯测定,为3.4 min。
精确称取10片阿替洛尔药片于研钵中,研磨成细小的粉末,准确称取一定量的样品粉末(约含阿替洛尔总量10 mg),用甲醇超声处理20 min,使药片充分溶解,用甲醇定容至100 mL。经0.45 μ m的有机滤膜过滤,作为待测溶液。
目前,文献[11, 12, 13]报道阿替洛尔对映体通常采用涂覆型Chiralcel OD-H纤维素类和键合型AD直链淀粉类商品柱在正相色谱条件下拆分。环糊精类固定相可以同时用于正相和反相色谱,并以反相色谱居多,操作便利[17]。本实验首先试用了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/醋酸三乙胺缓冲溶液(TEAA)作为流动相的反相色谱体系,均未观察到阿替洛尔对映体手性分离现象。后改用含不同体积比的乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺流动相的极性有机溶剂模式[18],成功地拆分了阿替洛尔对映体。可能是因为阿替洛尔含有氨基丙醇类结构,手性碳与极性的羟基、氨甲基、苯氧基、酰胺基相连,氢键作用更有利于手性拆分,反相色谱流动相中大量的水会削弱环糊精配体与阿替洛尔之间的氢键作用,使得R/S-阿替洛尔与环糊精形成的配合物稳定性差别很小,导致手性分离困难。而乙腈与水不同,它不是氢键给体,有利于溶质和配体之间的氢键作用。
为了实现阿替洛尔对映体的良好分离,本实验对流动相的组成进行了优化,发现只用乙腈作流动相时溶质无法被洗脱,当加入适量的甲醇后溶质才能被洗脱,甲醇的体积分数对溶质的保留有重要的影响。为了提高对映体的分离度(Rs),除添加甲醇外,还需添加适量的冰醋酸/三乙胺(HOAc/TEA)。基于环糊精类固定相的前期实验工作,我们发现流动相中添加等体积分数(2% )的HOAc/TEA时效果较好。在此比例下,随着甲醇含量的提高,溶质出峰加快,手性分离度也随之改善;但进一步地提高甲醇的含量,分离度反而迅速下降。当甲醇的体积分数保持在10%左右时分离度相对较好,可能是因为加入氢键给体甲醇,会影响溶质与环糊精配体间的氢键作用,溶质洗脱过快,在形成稳定的包结物之前就已被洗脱,分离度变差。所以选择甲醇的体积分数为10% ,进一步优化HOAc和TEA改性剂的含量。从图3可以看出,当固定TEA加入HOAc时,对映体的分离度先增大后减小,HOAc体积分数为2.5%时结果较好;当固定HOAc并加入3%(v/v)左右TEA时,分离度达到最大值1.73,且分析时间在20 min左右,有较高的分离效率。这可能是因为三乙胺降低了残存硅醇羟基对碱性药物(阿替洛尔)的影响,减小拖尾,提高柱效;加入冰醋酸可使碱性药物部分质子化，带上正电荷,与环糊精端口存在离子-偶极作用和氢键作用,使R/S对映体所形成的包结物的稳定性差别变大,手性分离度增大。这与Yuan等[19]发现的现象一致,他们也认为加入适量的冰醋酸有利于碱性药物的手性分离。所以,优化后的流动相的组成为:乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺(90 ∶ 10 ∶ 2.5 ∶ 3.0,v/v/v/v)。
实验中考察了流动相流速(0.3～1.0 mL/min)对分离度的影响。发现当流速较高时,溶质被快速洗脱,与固定相的作用力不够,分离度变差;而降低流速有利于分离,但分析时间延长。综合考虑,选取流速为0.5 mL/min。
温度的变化可能引起手性固定相手性空腔的构象发生改变,从而导致对映体选择性发生改变[20]。本文考察了温度对分离度和分析时间的影响,发现随着温度的降低,阿替洛尔对映体的分离度变好,表明在一定的温度范围内,对映体的拆分过程由焓控制[21],手性分离应在较低温度下进行,但较低的柱温会延长分析时间,不利于快速分析。因此,为兼顾分离度和分离速度,本实验选择柱温为20 ℃。
通过标准品溶液的多波长扫描发现阿替洛尔在波长229 nm和275 nm处有两个紫外吸收峰,前者吸收较强。由于流动相中的甲醇、三乙胺、冰醋酸在229 nm处也有一定的吸收,而在275 nm处只有溶质有紫外吸收,故选定检测波长为275 nm。
将外消旋阿替洛尔标准储备液(400 mg/L)从冰箱中取出,恢复至室温并摇匀,用甲醇适当稀释,得到质量浓度分别为5.0、10.0、50.0、100、200 mg/L 的标准工作溶液。由于外消旋的阿替洛尔标准品含等量的R和S对映体,每个对映体的质量浓度分别为2.5、5.0、25.0、50.0、100 mg/L。在上述优化的色谱条件下分离和测定。实验中经对映体标准品保留时间对照,发现S对映体先出峰。以峰面积为纵坐标(y),阿替洛尔对映体的质量浓度为横坐标(x,mg/L),绘制标准曲线,线性回归方程如下。第一对映体(S): y1=78472.45x1+35935.01,r=0.9992;第二对映体(R): y2=88380.64x2+49375.05,r=0.9989。
结果表明,阿替洛尔对映体在2.5～100 mg/L 范围内呈良好的线性关系。按3倍信噪比(S/N=3)确定两对映体的检出限均为0.2 mg/L。标准品的色谱图见图4。
对水、甲醇、乙腈等提取溶剂进行比较,发现阿替洛尔在水中的溶解度较低,而在甲醇中有较好的溶解度,回收率较高,且重现性好。在极性有机模式下应避免引入水,因此选择甲醇作为提取溶剂。
采用加标法测定样品中阿替洛尔的回收率,每个对映体进行2个加标水平(5.0、25.0 mg/L)的试验,每个水平连续测定5次,以测得量的平均值与加入量之比计算平均回收率。结果见表1。
取50 mg/L 的标准溶液样品经过5次重复测定,根据实验结果计算得S-阿替洛尔与R-阿替洛尔保留时间的RSD分别为0.49%与0.53% ,峰面积的RSD分别为0.86%与0.92% 。结果表明该方法重现性较好。
取50 mg/L 的标准溶液样品,分别于配制后的0、6、12、24、48、72 h测定,阿替洛尔两对映体保留时间的RSD小于0.92% ,峰面积的RSD小于1.37% 。结果表明阿替洛尔在72 h内的化学稳定性较好,适用于测定。
精密称取同一批次的阿替洛尔药片2号粉末等量样品5份,按1.3项预处理方法制备供试品溶液,平行测定5次,计算S-阿替洛尔与R-阿替洛尔保留时间的RSD分别为0.63%与0.88% ,峰面积的RSD分别为1.53%与1.86% 。结果显示该方法有较好的重复性。
按1.3节方法处理4个不同厂家批次的阿替洛尔药片,将所得溶液注入高效液相色谱仪中,测定对映体的峰面积,按上述回归方程计算3次测定的平均含量(见表2),样品色谱图见图5。
本文采用一种实验室自制的二硝基苯醚 β -环糊精键合有序介孔SBA-15液相色谱手性固定相,在极性有机模式下实现了阿替洛尔对映体的快速拆分,建立了一种测定阿替洛尔片剂中对映体含量的新方法。该方法具有选择性好、分析时间短、重现性好、测试成本较低等优点,在手性药物质量监测和相关药代动力学研究方面有良好的应用前景。
2014, Vol. 32 Issue (11): 1219-1224
PDF (1606 KB)
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