Alpert[1]在1990年首次提出的亲水作用色谱概念引起了人们极大的研究兴趣和广泛的关注。一些强极性化合物,如酰胺类化合物[2, 3]、核苷类化合物[4]、氨基酸[5]、碳水化合物[5, 6, 7]、多肽[8, 9]以及极性药物[10]等在常用的反相色谱固定相上不保留或呈现弱保留[11]的物质,在亲水作用色谱中可有效地分离和富集。此外,亲水作用色谱模式往往采用反相色谱的流动相系统,如乙腈-水,因此可以解决极性化合物在正相色谱流动相中溶解性差的问题,提高了方法的质谱兼容性[12]。
最具代表性的亲水作用色谱固定相往往是传统的正相色谱固定相,如未衍生硅胶和氨基键合固定相[12, 13],其主要缺陷在于柱效相对较低。近年来,研究人员开发了多种新型的亲水作用色谱固定相,包括多糖类[14, 15]、氨基酸类[16]、多肽类[17, 18]以及抗生素类[19]固定相,并成功地应用于多种极性化合物的分离富集[20]。中国科学院大连化学物理研究所梁鑫淼研究员课题组[15, 16, 17, 18]在发展新型亲水作用色谱固定相方面开展了大量工作。例如,该课题组[15]发展了一种新型的纤维素包覆的硅胶基质固定相,显示了杰出的分离选择性和富集糖肽的能力。此外,该课题组[17]进一步利用点击化学的方法将谷胱甘肽键合到硅胶基质上，制备了一种新型亲水/阳离子交换混合模式的固定相,成功实现了人血清白蛋白的胰蛋白酶酶切产物的分离,共检测到86条多肽,序列覆盖率可达85% 。武汉大学冯钰锜教授课题组[21]发展了一种新型的磷酸酯键合的亲水/疏水双重模式的色谱固定相,分别在亲水、疏水两种模式下实现了10种核苷和核酸碱基的有效分离。
咪唑类离子液体具有很多独特的化学和物理特性,如高热稳定性、良好的溶解度和低蒸汽压[22],已被成功地应用于分析化学的诸多研究领域[23, 24]。中国科学院兰州化学物理研究所的蒋生祥研究员课题组[25]首次将离子液体修饰的固定相用于色谱分离,此后涌现了多种咪唑修饰的固定相,并已成功地实现了多种类型物质的分离和富集[26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34]。本文通过将咪唑季铵离子液体嵌合到传统的氨基硅胶固定相中,合成了新型咪唑嵌合的氨基亲水作用色谱固定相(Sil-IEASP),实现了极性化合物和位置异构体的有效分离,结果优于常用的氨基键合固定相。
P230Ⅱ高效液相色谱系统(大连依利特分析仪器有限公司); TGA/SDTA851E热重分析仪(美国Perkin-Elmer公司); VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker Optik公司); CE-440元素分析仪(美国加联仪器有限公司)。
硅胶(粒径5μ m,孔径10 nm)购自大连思谱精工有限公司;(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPS;纯度97% )、2-溴乙胺氢溴酸盐(纯度99% )、偶氮二异丁腈(AIBN)、尿嘧啶(纯度98% )、腺嘌呤(纯度99% )、胞嘧啶(纯度99% )和尿苷(纯度99% )均购于北京百灵威科技有限公司;1-乙烯基咪唑(纯度＞98.0% )、苯并菲(纯度＞96.0% )、间三联苯(纯度＞98.0% )购于日本Tokyo Chemical Industry公司;邻三联苯购于上海Tokyo Chemical Industry公司;(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(纯度97% )购自上海韶远化学科技有限公司;色谱纯甲醇购于美国Thermo Fisher Scientific公司;色谱纯乙腈购于上海星可生化有限公司。
Sil-IEASP的合成过程如图1所示。首先,参考文献[27]合成了MPS修饰的硅胶(Sil-MPS):取硅胶3 g置于烧瓶中,加入无水甲苯20 mL、MPS 3 mL,混合均匀后在氮气保护下于110 ℃回流反应24 h,得到的填料采用甲苯、甲醇反复清洗,即得Sil-MPS;然后,通过点击化学的方法合成1-乙烯基咪唑修饰的硅胶(Sil-Im):将制得的Sil-MPS加入烧瓶中,加入AIBN 0.3 g作为催化剂、氯仿20 mL、1-乙烯基咪唑6 g,混合均匀后在氮气保护下于60 ℃回流反应24 h,得到的填料用氯仿、甲醇反复清洗即得Sil-Im;最后,制备氨基修饰的咪唑嵌合固定相Sil-IEASP:将上步制得的Sil-Im填料溶解在20 mL无水乙醇中,加入2-溴乙胺氢溴酸盐6 g,然后在氮气保护下于80 ℃回流反应24 h,得到的产物用乙醇和甲醇反复洗涤、真空干燥后即得Sil-IEASP。
常用的氨基键合固定相制备过程如下:取硅胶2.6 g,分散在20 mL无水甲苯中,加入3-氨基丙基三甲氧基硅烷2.6 mL,然后在氮气保护下于110 ℃回流反应24 h,所得填料用甲苯和甲醇反复清洗、真空干燥后即得氨基键合固定相。
首先将合成的填料分散在甲醇中超声5 min以制备匀浆液,然后用高压色谱泵在40 MPa的压力下将匀浆液注入不锈钢柱管中(150 mm×4.6 mm),保持20 min。填装完毕后采用甲醇以1 mL/min 的流速冲洗1 h,即可使用。
色谱分离过程采用等度洗脱,柱温25 ℃,流速1 mL/min,紫外检测波长254 nm。分离核苷和核酸碱基所用流动相为85%(v/v)的乙腈溶液;分离邻三联苯、间三联苯和苯并菲所用流动相为甲醇。
首先采用红外光谱表征了未修饰的硅球、Sil-Im和Sil-IEASP。如图2所示,硅球中 1110 cm-1处的吸收峰是硅胶中Si-O键的伸缩振动峰;与1-乙烯基咪唑反应后,分别在 1515 cm-1和667 cm-1处出现了两个吸收峰,这是咪唑中C=C和C=N的伸缩振动和弯曲振动吸收峰,表明咪唑基团已经成功地嵌入到硅胶中。然而,从Sil-IEASP的红外光谱图中很难确定氨基是否键合到硅球上,所以进一步采用热重分析的方法对Sil-Im和Sil-IEASP进行了表征。如图3所示,与Sil-Im相比,Sil-IEASP损失了大约5%的重量,由于200 ℃以上的质量损失来自于有机结构的损失,可归因于烷基氨的丢失。上述结果表明烷基氨结构已成功地键合到硅球上。
为了进一步验证烷基氨基团已键合到硅球上,采用元素分析仪表征了Sil-Im和Sil-IEASP。Sil-Im中C元素、H元素和N元素的含量分别为9.77% 、1.57%和3.75% ;而Sil-IEASP中这3种元素的含量分别为10.89% 、2.36%和4.38% 。与Sil-Im相比,Sil-IEASP中C元素、H元素和N元素含量均有一定增加,从而进一步确定了烷基氨基团已成功地键合到硅胶上。
以尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和尿苷为分析物,考察了流动相中水的含量、盐浓度以及流动相pH对其色谱保留性能的影响。如图4a所示,随着流动相中水含量的增加,4种化合物的保留呈现逐渐减弱的趋势,属于典型的亲水作用色谱分离机制。流动相中的缓冲盐会影响溶质的存在形式,因为溶质可与固定相发生静电相互作用,从而影响溶质的保留行为,因此进一步考察了流动相中甲酸铵的浓度对色谱保留性能的影响。如图4b所示,在甲酸铵浓度为10～100 mmol/L 范围内,随着流动相盐浓度的增加,上述物质的保留未发生显著变化,其可能的原因是在当前条件下,溶质未发生解离,从而受盐浓度影响较小。此外,在pH 3.4～6.4的范围内考察了pH对核苷和核酸碱基保留的影响,结果发现该类物质的保留不受溶液pH的影响(见图4c),其可能的原因是核苷和核酸碱基在本文考察的pH范围内没有解离,以分子形式存在,因此pH对核苷和核酸碱基保留的影响较小[27]。
在优化的分离条件下,考察了所发展的Sil-IEASP固定相对尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和尿苷的分离效果,并与常用的氨基键合固定相进行了比较。如图5a所示,4种物质均有较强的保留并达到了基线分离,且具有较高的分离度,理论塔板数高达 75000 N/m。然而,在相同的色谱分离条件下,尿嘧啶、胞嘧啶和尿苷在常用的氨基键合固定相上的分离度较差,其柱效介于 51000和 63000 N/m之间,低于Sil-IEASP固定相。上述结果表明Sil-IEASP固定相可实现有效的亲水作用色谱分离。
进一步将Sil-IEASP材料用于位置异构体邻三联苯、间三联苯和苯并菲的分离,并与常用的氨基键合固定相进行了比较。如图6a所示,在常用的氨基键合固定相上邻三联苯、间三联苯和苯并菲不能实现基线分离;然而,在同样的色谱分离条件下,采用本文所发展的Sil-IEASP材料,成功地实现了苯并菲与邻三联苯和间三联苯的基线分离(见图6b),表明Sil-IEASP材料在分离位置异构体方面具有一定的优势。
本文设计合成了一种新型的咪唑嵌合氨基固定相并用于亲水作用色谱分离。与常用的氨基固定相相比,本文所合成的Sil-IEASP材料在分离核苷、核酸碱基以及位置异构体方面具有更好的分离效果和选择性,有望在极性物质的分离分析中发挥重要作用。
2014, Vol. 32 Issue (10): 1079-1083
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