高速逆流色谱仪(TBE-20A,TBE-300B,上海同田生化技术有限公司);高效液相色谱仪(Angilent 1100,美国安捷伦公司);冷冻超微粉碎机(SQW-601,山东三清不锈钢设备有限公司);超声破碎仪(XODL-1000N,南京先欧仪器制造有限公司);多样品平行蒸发仪(Multivapor P-6,瑞士BVCHI公司);超纯水机(Millipore公司)。

中药诃子购于福建铭远制药有限公司;HSCCC分离中所用的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、醋酸、无水乙醇等试剂均为分析纯(西陇化工股份有限公司); HPLC分析中所用甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司),磷酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司),水为超纯水。没食子酸对照品(纯度≥98% ，北京世纪奥科生物技术有限公司)。

采用分析型HSCCC考察了5个分离体系(见表1)。结果发现,采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5,v/v/v/v)的分离效果最好(见图2),得到4个峰(组分Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ),分离时间为50 min,固定相保留率为45% ,达到逆流色谱分离要求。实验中还发现,适当降低流速、提高转速可提高保留率,但流速太小时分离时间过长,转速过大时体系易出现乳化现象。进样量也影响各峰的分离度,进样量太大会导致峰间距变窄,峰形变宽,分离度降低。因此,最终确定分析型HSCCC的流速为1 mL/min,转速为 1800 r/min,进样量为2 mg。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 诃子主要成分分离的HSCCC溶剂系统的优化 Table 1 Optimization of the solvent systems of HSCCC for the separation of main constituents from Terminalia chebula Retz. Solvent system (volume ratio) Rotation speed/ (r/min) Flow rate/ (mL/min) Retention ratio of stationary phase/% n-Hexane-ethyl acetate-methanol-water (1∶1∶1∶1) 1600 1.0 46 Ethyl acetate-ethanol-water (5∶1.5∶5) 1600 1.0 15 Ethyl acetate-n-butanol-0.44% acetic acid (5∶1∶8) 1600 0.5 26 n-Hexane-ethyl acetate-methanol-water (1∶5∶1∶6) 1700 1.0 35 n-Hexane-ethyl acetate-methanol-water (1∶5∶1∶5) 1800 1.0 45

表1 诃子主要成分分离的HSCCC溶剂系统的优化 Table 1 Optimization of the solvent systems of HSCCC for the separation of main constituents from Terminalia chebula Retz.

图2

Fig. 2

图2 分析型高速逆流色谱分离诃子醇提物的色谱图 Fig.2 Chromatograms of crude extract from Terminalia chebula Retz. by analytical HSCCC Solvent systems: a. n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1,v/v/v/v); b. ethyl acetate-ethanol-water (5 ∶ 1.5 ∶ 5,v/v/v); c. ethyl acetate-n-butanol-0.44% acetic acid (5 ∶ 1 ∶ 8,v/v/v); d. n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 6,v/v/v/v); e. n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5,v/v/v/v).

以分析型HSCCC优化的溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5,v/v/v/v)为参考,经微调流速和转速后可直接用于制备型HSCCC进行放大制备,重复2次进样,分离图谱见图3。该体系放大 应用于制备型HSCCC,重现性好,也可分离出4个组分峰,各组分的保留时间、分离度及峰形与分析型色谱的结果基本一致,且第一次进样和第二次进样分离的峰形也一致,表明该溶剂体系稳定性好,线性放大方法具有可行性及高效性。在确定溶剂体系后,通过综合各参数的影响,确定制备型HSCCC的流动相流速为2 mL/min,转速为850 r/min。进样量对各峰的分离度影响最大，当制备型HSCCC进样量达到100 mg以上时,前3个峰的分离度大大降低。因此每次最大进样量为100 mg,并采用多次连续进样,这样可以省去平衡时间,节约溶剂,提高产物得率。各分离组分的含量见表2。在该条件下,体系的固定相保留率为63% ,较分析型的有所增加,分离得到8.6 mg没食子酸。与制备型HSCCC相比,分析型HSCCC的灵敏度高、分离时间短,样品的进样量、流动相的流速、转速对分离效果的影响更大。但由于分析型HSCCC主要用于筛选分离溶剂体系,本研究中未对分析型HSCCC的分离条件进行再优化,而只优化了制备型HSCCC的分离条件。故从图谱上可以明显看出制备型的分离效果好于分析型。

图3

Fig. 3

图3 制备型HSCCC分离诃子没食子酸色谱图 Fig.3 Chromatograms of gallic acid extracted from Terminalia chebula Retz. by preparative HSCCC

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 制备型高速逆流色谱分离诃子的各主要组分的分析结果(n=3) Table 2 Analysis results of the main constituents from Terminalia chebula Retz. by preparative HSCCC (n=3) Fraction No. Content±SD/% Purity/% Ⅰ 35.22±0.13 38.60 Ⅱ 24.63±0.11 47.10 Ⅲ 17.24±0.09 96.40 Ⅳ 22.91±0.14 88.65

表2 制备型高速逆流色谱分离诃子的各主要组分的分析结果(n=3) Table 2 Analysis results of the main constituents from Terminalia chebula Retz. by preparative HSCCC (n=3)

采用1.2.4节中的色谱条件对收集的各组分进行检测的结果见表2,按照峰面积归一法计算,得到组分Ⅲ的纯度为96.4% ,HPLC谱图见图4a。将该组分与没食子酸标准品(见图4b)进行HPLC对比分析,结果表明两者的峰形及保留时间完全一致。对组分Ⅲ进行电喷雾电离质谱分析(见图5),结果显示[M-H]^- (m/z 169)、[M-H-CO₂]^- (m/z 125)与文献^[13]中报道的没食子酸质谱数据一致,即没食子酸的相对分子质量为170,在负离子模式下脱去一个H后为169,脱去一个CO₂后为125。另外,计算分子离子峰的同位素相对丰度比,并与IsoPro 3.0软件计算得到的没食子酸同位素相对丰度比相比较,发现两者的比值一致。因此,可以确定组分Ⅲ为没食子酸,且纯度达到96.4% 。与已报道文献中的研究结果比较,如Lu等^[14]采用逆流色谱并结合制备液相色谱法从石榴皮中纯化没食子酸,采用乙酸乙酯-甲醇-水(50 ∶ 1 ∶ 50,v/v)体系,分离得到的没食子酸纯度为26.7% ,再经制备液相色谱纯化后没食子酸的纯度达到96% ,而本文方法可以一步纯化得到高纯度的没食子酸。

图4

Fig. 4

图4 (a)组分Ⅲ和(b)没食子酸标准品的HPLC谱图 Fig.4 HPLC chromatograms of (a) fraction Ⅲ and (b) gallic acid standard substance Fraction Ⅲ: 0.015 mg/mL; standard solution: 0.020 mg/mL; injection: 20 μ L.

图5

Fig. 5

图5 组分Ⅲ的质谱图 Fig.5 MS spectrum of fraction Ⅲ