随着科学技术的发展、经济列车的不断加速,与人们生活息息相关的各领域发展迅猛,现代分析化学在复杂样品分析中的应用正面临着新的挑战。上世纪80年代,Jorgenson和Lukacs[1]首次使用毛细管区带电泳快速分离了多种氨基酸和多肽,柱效高达4×106块塔板/m。此后,通过在毛细管两端施加高压电场以获得极高分离效率的电泳技术获得了世人的瞩目,并迅速发展成为可以与气相色谱、液相色谱相媲美的分离技术,并被广泛应用于食品安全、环境科学及生物医学分析等领域。毛细管电泳是根据不同物质在高压电场中的淌度及分配系数的差异在毛细管中实现分离的技术。它具有分析速度快、分离效率高、操作方便、试剂消耗量少及应用广泛等优点。毛细管电泳中常用的检测方式有紫外检测与激光诱导荧光检测。激光诱导荧光检测的检测灵敏度较高,通常需要对样品中的待测物进行衍生化才可以进行检测[2, 3];紫外检测应用更广泛,但由于样品基质复杂、毛细管进样量极少(nL级)、检测光程短等[4],普适性的UV检测灵敏度常常达不到实际样品的分析要求,因此需要辅以合适的样品前处理技术及毛细管电泳在柱富集技术以净化样品基质并提高其检测灵敏度,拓宽其应用范围。
在柱富集技术是毛细管电泳特有的富集技术,仅通过调节目标分析物所处状态以及仪器参数等即可获得高倍富集,具有自动化、操作简便等优点;然而仅通过在柱富集技术无法直接对复杂基质样品进行分析,因此需要辅以合适的样品前处理技术以分离基体,从而满足仪器的检测要求。当今分析化学朝着微型化、自动化、高效智能的方向发展,涌现了多种模式的微型化样品前处理技术,如单滴微萃取、中空纤维膜液相微萃取、纤维固相微萃取、搅拌棒吸附萃取以及毛细管微萃取等,以满足对复杂基质中各类物质的分析的要求。本文主要对近年来毛细管电泳分析中的在柱富集技术及其应用、微型化样品前处理技术、微萃取技术与在柱富集技术的联用等3个方面进行综述和分析。
在柱富集技术充分利用了毛细管的分离特性,通过控制缓冲液与样品溶液的差异,结合目标分析物的电泳分离原理控制仪器运行参数,即可实现目标分析物的高倍富集[5]。在柱富集技术无需对仪器进行任何改装,操作简便快速,可选择模式众多,富集倍数高,在一定程度上克服了毛细管电泳进样量少的弊端,大大提高了方法的灵敏度,因而近年来发展迅速,并得到了广泛的应用,Wen等[4]在2012年对其进行了总结与分析。在柱富集主要通过改变目标分析物在毛细管内的迁移速率实现,改变目标分析物的迁移速率有多种方式:(1)增大样品基质与缓冲电解质的电导差异;(2)增大两区带的pH差异;(3)在背景电解质中添加假固定相;(4)改变样品区带前后背景电解质的电迁移速率。基于这些方式,目前常用的在柱富集技术主要有堆积、动态pH界面、吹扫、瞬间等速电泳等,这些技术的性质特点见表1。
样品堆积(sample stacking)是一种较常用的在柱富集技术,通常需要引入不连续的电解质,依靠离子在不同电解质中迁移速率的变化实现富集,因此堆积通常发生在界面处[6]。依据进样方式的不同,样品堆积可分为压力进样与电动进样两种,其中压力进样适用于带电荷以及不带电荷的目标物,而电动进样适用于带同种电荷的目标物。
采用压力进样的样品堆积方法有常规堆积(normal stacking mode,NSM)[7]和大体积样品堆积(large volume sample stacking,LVSS)。常规堆积又称场放大样品堆积(field amplified sample stacking,FASS),是所有堆积中最简便的堆积方式,它是通过将样品溶解在低电导的溶液中,压力进样较长一段样品,随后施加电压进行正常分离。该方式进样时间不宜太长,过多地注入样品会使其在毛细管中发生层流而导致峰展宽,这种堆积方式的富集倍数在10左右。Li等[8]采用堆积分别与胶束电动色谱及微乳液电动色谱联用对尿液中的嘌呤进行测定,得到的富集倍数分别为12~32和28~33。与常规堆积相比,LVSS具有更大的进样量,可根据实际情况控制进样量,并通过极性转换和控制电渗流使样品基质从进样端排除,在不影响分离效果的情况下获得更高的富集倍数。由于常规毛细管电泳中的电渗流方向与所施加的电压方向一致,根据基质排除方式的不同将大体积样品堆积分为有极性转换[9]和没有极性转换的大体积样品堆积[10]。Honegr等[11]在充满缓冲溶液的分离毛细管内注入占毛细管总长50%的样品溶液,采用大体积样品堆积毛细管电泳分析药用植物中的8种多酚类化合物,经过极性转换将样品基质从进样端排出后富集倍数可达90以上。Chamoun等[12]采用有极性转换的LVSS结合CE-ICP-MS(电感耦合等离子体-质谱)分析金属与蛋白质之间的相互作用,进样量增大了10倍,提高了分析方法的灵敏度。有极性转换的大体积样品堆积富集倍数高,但仍存在不足:由于堆积时要极性转换,需实时监控电流,易影响实验重现性。对于某些商品化的仪器,无法实现极性转换,欲实现大体积样品堆积需要抑制电渗流,可以通过对毛细管进行内壁涂层改性或在背景电解质中添加阳离子表面活性剂来实现。利用该方法也可以对阳离子进行富集,Quirino等[13]通过在酸性缓冲液中加入阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)使电渗流反向,实现了多种药物的在柱富集。
大体积样品堆积的富集倍数高达几十至上千[14, 15, 16],但只能富集带同种电荷的离子,不能同时富集阳离子和阴离子,且主要对电迁移速率较大的物质有较好的富集效果。
主要有场放大进样(field enhanced/amplified sample injection,FESI/FASI)与选择性耗尽进样。FESI是利用电泳和电渗的合力使离子在电场的作用下进入毛细管内以实现堆积。将样品配制在低电导的溶液中,通过电动进样使离子在界面处堆积,电迁移速率越快的离子堆积效果越好。因为FSEI没有引入样品基质,长时间进样也不会出现峰的展宽,这种电动进样的方式相比场放大样品堆积具有更高的富集倍数。为了防止离子从进样端流失,Chien等[17]在电动进样前往毛细管进样端注入一小段水柱,不仅提高了富集倍数,也改善了实验的重现性。Zinellu等[18]采用场放大进样技术检测了生物样品中的3种多肽,与常规进样相比灵敏度提高了500倍。李玉琴等[19]利用场放大进样-毛细管电泳方法测定了中药口服制剂中苯甲酸和山梨酸的含量,富集倍数达259.7和231.9;卢玉超等[20]采用场放大样品堆积技术检测了染发剂中的7种苯胺类物质,灵敏度提高了1~3个数量级。Airado-Rodriguez等[21]采用FASI技术分析了尿液中的多种药物,检出限达1.00~4.50 ng/mL。
选择性耗尽进样是在毛细管两端施加正/负电压选择性地对样品中的阴/阳离子进样,该方法基本可以将样品中的所有目标离子引入至毛细管中,因此称为耗尽进样,并分为阴离子耗尽进样(anion selective exhaustive injection,ASEI)和阳离子耗尽进样(cation selective exhaustive injection,CSEI)两种模式[22]。Li等[23]采用阴离子耗尽进样结合中空纤维膜液相微萃取分析环境样品中的苯砷酸类化合物,其中ASEI步骤的富集倍数达到236,经过样品前处理和在柱富集步骤,整个方法的灵敏度提高了3个数量级。已有的阳离子耗尽进样应用中,较多的是将其与吹扫技术结合,通过分析物与假固定相之间的作用而得到富集[24, 25]。但同LVSS一样,选择性耗尽进样也不能同时分析阴离子和阳离子,只适用于电迁移速率较快的物质。
吹扫法(sweeping)最初应用于胶束电动色谱中在柱富集中性物质,这种富集方式需要在背景电解质中加入假固定相,后来越来越多的研究者将其用于带电离子的分析中。常用的假固定相包括表面活性剂和聚合物等,可分为阴离子和阳离子假固定相[26]。阴离子假固定相常用于中性化合物和阳离子的分析,最常用的是十二烷基硫酸钠(SDS)[27, 28, 29];阳离子假固定相常用于阴离子和中性化合物的分析,十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)[30, 31]、十六烷基三甲基溴化铵CTAB[32, 33]、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)[34]等常用于阴离子的吹扫富集。此外,环糊精[35]、乙二胺四乙酸(EDTA)[36, 37]等与特定的目标物有较强亲和作用力的试剂,也常常被用作吹扫的假固定相。Znaleziona等[38]以SDS为假固定相,采用毛细管电泳吹扫法分析尿液中的尼鲁米特,检出限达26μ g/L,该方法抗盐能力强,为后续尿液中的药物分析提供了新思路。王全等[39]建立了以SDS为假固定相的胶束毛细管电泳吹扫富集面粉中的增白剂过氧化苯甲酰的方法,富集倍数达150以上。除了对有机物进行分析之外,吹扫法还可用于无机物的分析。Isoo等[34]采用CTAC作为假固定相对Cu2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Pb2+与环己二胺四乙酸(CDTA)形成的阴离子配合物进行捕获以实现富集。
吹扫法可以同时对带电离子和中性目标物进行富集,且易与其他在柱富集技术联用,其不足之处在于假固定相种类有限,在实际应用中需要寻找与目标分析物亲和作用力强、反应速率快且紫外响应低的物质作为假固定相。
动态pH界面富集法(dynamic pH junction,DpHJ)是通过控制样品溶液与背景电解质的pH差异来实现的,对弱碱或弱酸甚至是两性物质有较好的富集效果[40]。Hasan等[41]采用动态pH界面-CE分析了细胞中的多种多肽,富集倍数达到上万;Chen等[42]将动态pH界面与吹扫结合用于人血清中4种二肽的富集,其检出限达到pmol/L级。动态pH界面富集方式适用于在不同pH条件下带电荷情况会发生变化的物质,因此多应用于弱酸、弱碱及两性物质,如氨基酸、多肽及蛋白质等的分析应用中[40, 43, 44, 45]。
瞬间等速电泳(transient isotachophoresis,t-ITP)富集法主要是基于离子在不同场强溶液中迁移速率的变化而实现富集的,目前已用于各种小分子和大分子(如蛋白质)的分析[46]。瞬间等速电泳与其他富集方式相比有其自身优点:(1)瞬间等速电泳对目标物的富集原理是基于样品溶液的电导与前导电解质(leading electrolyte,LE)和尾随电解质(terminating electrolyte,TE)的不同,因此可以选择不同的LE和TE来适应样品的电导要求,不再局限于分析低电导样品;(2)等速电泳可以去除样品中复杂基质对目标物分离检测的干扰;(3)等速电泳是毛细管电泳的一种分离模式,瞬间等速电泳富集可以提高各峰的分离度[47]。基于以上优点,瞬间等速电泳已广泛应用于基质复杂的样品分析中[48, 49, 50]。Bortello等[51]采用瞬间等速电泳富集法分析人血清和尿样中的多种非甾体类抗炎药,富集倍数达45。除了将等速电泳用于分析小分子外,Oukacine等[52]还将场放大进样与瞬间等速电泳结合用于水样中细菌的分析,从而拓宽了其应用领域。
以上在柱富集技术各有优缺点,采用双在柱富集技术将不同在柱富集技术的优点结合起来,可进一步提高分析方法的灵敏度。其中由于吹扫法富集倍数高,且易与其他在柱富集技术结合,将其与堆积或动态pH界面结合的双在柱富集技术应用最广。
堆积与吹扫结合的双在柱富集技术又包括3种:SEI-sweeping[24, 25, 53, 54, 55, 56, 57]、LVSS-sweeping[58, 59, 60, 61]和FSEI-sweeping[29, 62, 63]。阳离子耗尽进样-吹扫富集法(CSEI-sweeping)已被用于环境样品和生物样品中碱性有机物的分析。Xu等[55]采用CSEI-sweeping-MEKC(胶束电动色谱)富集血清中的可铁宁,富集倍数达 5000 倍。Maijo等[53]将ASEI-sweeping-MEKC方法用于分析环境样品中的多种抗炎药物,15 min内便完成整个分析过程,且方法抗基体干扰能力较强。Huang等[64]采用ASEI-sweeping-MEKC分析苹果汁、红酒等饮料中的没食子酸和儿茶酸,富集倍数高达 96000~238000。除此之外,还有研究者充分利用仪器进样系统的可调控性来提高检测灵敏度,巧妙地设计了重复大体积样品堆积-吹扫富集方式(rLVSS-sweeping)用于人尿样中的雄性激素检测,此方法重现性好,富集倍数高达 2500[59]。双在柱富集法可根据目标分析物的性质进行改进,以满足实际分析的需要。Wei等[29]将场放大进样与吹扫结合用于酸性和碱性药物的同时分析,该方法成功地将阴离子耗尽与阳离子耗尽结合起来,实现了带正、负两种电荷物质的同时分析,并成功地应用于临床分析中,具有很好的应用前景。
对于电迁移速率较低的物质的富集,如两性物质以及蛋白质大分子,可以将动态pH界面与吹扫相结合。Chen等[42]采用DpHJ-sweeping方法分析人血清样品中的多种多肽;Yu等[65]也采用DpHJ-sweeping对中药中的有害生物碱进行了分析。该方法操作简单,富集倍数高。
除上述几种较常用的双在柱富集技术外,还有研究者根据目标物的电泳性质设计新的双富集技术如LVSS-RpHJ(大体积样品堆积-反向pH界面)[66]、FASS-LVSS[67]、t-ITP-FASI[49]等以提高方法的灵敏度。
随着各项研究的日益发展,具有分离效率高、经济、易于自动化、环境友好等优点的毛细管电泳被广泛应用于多种化合物的分离分析,包括无机离子、有机酸、药物、糖类等小分子,以及氨基酸、多肽和蛋白质等大分子物质。因此随之发展起来的在柱富集技术也在环境、生物、医药、食品等领域得到了广泛的应用。
随着生活水平的提高,人们对食品质量的要求也越来越高。目前,许多化学试剂如农药、兽药、抗生素等存在于食品中,危害人类的身体健康,因此对食品的安全控制及营养评价是食品分析领域的研究热点,近年来CE在食品中的应用日趋广泛[68, 69, 70]。已有许多研究者利用毛细管电泳在柱富集技术检测食品中的重金属形态[71]、食品添加剂[72, 73, 74]以及污染物[75]等。LVSS-CE-UV被用于食品中的除草剂[76]、汞元素形态[77]等的分析,具有快速简便的优点。Bermudo等[78]将FASI用于分析饼干、谷类食品、咖啡中的丙烯酰胺,检出限为1 ng/mL。食品营养评价在食品营养学以及临床医学中均具有重要的意义,如黄酮类物质具有防治癌症、降低心脑血管发病率等作用。Lee等[79]采用LVSS分析甘蓝中的黄酮类物质,8 min即可完成整个分析过程。维生素B2是人体必需的营养物,缺乏维生素B2易导致各种炎症。Su等[80]采用动态pH界面-吹扫富集法与CE-LED联用分析啤酒中的维生素B2,检出限为1 ng/mL,此类分析方法对于食品营养学研究具有一定的指导意义。
CE在柱富集技术应用于环境分析中,其主要样品来源是水、土壤和大气,其中水质分析应用最多。在柱富集技术已用于环境水样中的化学战剂[81]、有机酸[82, 83]、农药、兽药以及抗生素[53, 84, 85, 86]等的分析。Li等[81]采用搅拌棒吸附萃取结合LVSS分析东湖水和长江水中的磷化学战剂降解产物,将检测灵敏度提高了3个数量级。为了分析河水中的全氟辛酸等重要的环境污染物,Knob等[83]比较了LVSS与FASI两种在柱富集方法,结果表明FASI对目标分析物的富集效果更好,富集倍数在624~806之间。环境水样中的抗生素残留会威胁人类的健康,Herrera-Herrera等[84]采用多壁碳纳米管分散相固相萃取与大体积样品堆积毛细管电泳联用方法分析多种水样中的喹诺酮类抗生素,检出限达ppt级。目前在柱富集技术用于土壤和大气中污染物的分析相对较少。
药物分析包括明确药物(天然药物与合成药物)制剂含量和临床药物分析两大部分。合成药物的药代动力学研究对临床应用有重要意义,吹扫富集法[87]和场放大样品堆积[88]已分别被用于抗组胺和氟西汀的药代动力学性质研究,其富集倍数高达上千。活体实验是药物药性分析的重要环节,Hefnawy等[89]采用反向迁移假固定相选择性地对老鼠血清中的安眠药“HIE-124”进行堆积,该方法分析快速,抗干扰能力强。中药为传统中医所特有的药物,其主要成分及杂质的确定对中药制剂学有重要的指导意义。毛细管电泳由于其超高的分离效率而被许多研究者用于中药的研究中。目前,场放大进样[90]已被用于中药中黄连素、药根碱和巴马亭等的含量确定,动态pH界面和吹扫富集法[65, 91]已被用于检测中草药中的生物碱,检出限达ppb(10-9)级。
毛细管电泳在生物医学中的应用包括基础生物学和临床医学两大部分。在临床医学及法医鉴定分析中,常常需要对生物体液如血清[38, 42, 55]、尿[87, 92]、脑髓液[93]等样品进行分析,此时分析速度快、进样量小的毛细管电泳是最优选择之一。生物样品基质较复杂,通常需要选择合适的在柱富集方式以满足分析要求。如分析氨基酸、多肽、蛋白质等常采用动态pH界面富集方式[43];对于电迁移速率快的小分子物质如兴奋剂[49]等采用FASI富集法有较高的富集倍数。此外,已有研究将在柱富集技术用于法医鉴定体液中的鸦片及海洛因的测定[94],在柱富集技术还可用于对细菌[14]等的富集,以改善分析灵敏度。Wu等[95]巧妙地将微流控芯片与毛细管连接,在芯片与毛细管中利用二维瞬间等速电泳实现在线除盐富集过程,对临床尿样中的4种标志性蛋白质进行快速检测,其分析时间是常规的酶联免疫分析方法的1/40。在毛细管电泳分析中,无论是小分子还是蛋白质等生物大分子,甚至是细菌、细胞等均可采用在柱富集技术提高检测灵敏度,可见在柱富集技术在生物医学分析中极具应用价值。
随着科学技术的发展,对目标分析物的检出限要求越来越低,尽管毛细管电泳可以结合在柱富集技术克服其进样量小的缺点,从而提高分析灵敏度,但要直接分析复杂基质样品中的目标分析物还可能遇到一定困难:样品中目标分析物的存在形式及其含量无法满足仪器的检测要求;样品中的复杂基质会干扰仪器的分离检测,影响实验准确性。合适的样品前处理技术不仅可以去除基质干扰,还可以使目标分析物得到富集,满足仪器的检测要求。可见,样品前处理技术是实际样品分析过程中一个极其重要的环节,传统的样品前处理技术有过滤、离心、吸附、萃取及蒸馏等。其中萃取技术(包括固相萃取(SPE)与液液萃取(LLE))集提取、净化、浓缩于一体,应用最为广泛,然而它们普遍具有试剂消耗量大、操作繁琐、污染环境等不足。为适应快速、便捷、环境友好的化学发展方向,在SPE和LLE基础上发展起来的绿色新型前处理技术如固相微萃取技术(solid phase microextraction,SPME)与液相微萃取技术(liquid phase microextraction,LPME)等在近几十年内得到蓬勃发展,下面将对毛细管电泳分析中的微萃取技术进行详细阐述。
SPE是根据目标分析物在固定相与样品溶液中的分配差异实现萃取过程的,自问世以来得到了非常广泛的应用,但有样品消耗量大、操作繁琐、费时等缺点,在其基础上发展起来如纤维固相微萃取(fiber-solid phase microextraction,fiber-SPME)、毛细管微萃取(capillary microextraction,CME)、搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction,SBSE)等新型微型化的固相微萃取技术,近年来在各领域得到了广泛应用。
fiber-SPME具有分析快速、无需消耗有机溶剂、易于与各类仪器联用等优点,自其发展以来得到了众多研究者的青睐[96, 97, 98]。fiber-SPME与毛细管电泳联用有在线和离线两种模式,大多为离线模式。Deng等[99]采用甲基丙烯酸作为单体合成了分子印迹聚合物涂层SPME,与CE联用用于生物样品中麻黄碱与伪麻黄碱的分析,该方法选择性高,分析快速。Kannamkumarath等[100]合成了耐酸性强的环己胺丙磺酸羧基改性的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)涂层SPME,并将其与CE-ICP-MS联用用于河水样品中含碘苯酚的形态分析。目前将fiber-SPME直接与CE在线联用还存在以下问题:毛细管内径与萃取纤维头外径通常不匹配,需要自主设计更细的萃取纤维头以适应CE分离的需求;溶剂解吸速度较慢,可能会引起峰展宽;毛细管内径限制了涂层用量,使得富集倍数较低,甚至无法达到净化样品的目的。因此,目前将fiber-SPME与CE在线联用有一定难度,对操作者的要求较高,相关的应用也较少[101, 102]。
SBSE有热解吸与溶剂解吸两种模式。热解吸模式通常与GC联用,而溶剂解吸常与HPLC联用。溶剂解吸体积通常大于10μ L,而CE进样量远小于其解吸体积,部分进样通常会降低分析方法的灵敏度,因此SBSE与CE离线联用的相关报道较少。Li等[81]采用PDMS粘附法将纳米ZrO2涂覆在搅拌棒表面,制备了对于含磷化学战剂降解产物有选择性的萃取搅拌棒,结合CE大体积样品堆积在柱富集法用于环境样品的分析。此外,已有研究者将SBSE与CE联用用于分析食品、环境样品中的苦味酸[103]、多环芳烃[104]以及农药[105]等。
CME是Pawliszyn课题组[106]提出的一种新型的固相微萃取技术,是将固相萃取材料固定在毛细管内,分别通入样品液/解吸液以实现萃取/解吸,这样有效地克服了fiber-SPME萃取纤维易折断、吸附容量低、涂层易流失等缺点,且便于与CE、HPLC、ICP-MS等仪器在线联用,实现自动化,因而近年来备受青睐。CME与CE离线联用是通过溶剂解吸把目标物洗脱后用于后续分析。Wei等[107]采用聚甲基丙烯酸-乙二醇整体柱与CE联用分析尿液中的苯丙胺及其衍生物。由于CME以毛细管作为固定相支撑介质,其与CE在线联用相比其他固相微萃取装置更易实现,可通过直接将含有萃取材料的毛细管与分离毛细管相连,也可通过在分离毛细管前端原位合成制备萃取毛细管实现[108, 109]。Jinno等[110]早在2001年就设计了纤维管内固相微萃取与毛细管电色谱在线联用分析三环类抗抑郁药的装置,通过泵完成样品的萃取与解吸过程,使萃取后的目标物转移至交叉接口处,随后进入毛细管进行正常分离。Lin等[111]在萃取毛细管与分离毛细管之间引入六通阀,首次将管内固相微萃取与毛细管电色谱在线联用用于尿液中药物的手性拆分,实现萃取分离一体化,自动化程度高。
总体来说,以上几种固相微萃取技术在与CE离线联用时,由于解吸体积较大,与CE进样量不是很匹配;而将其与CE在线联用时,需要对装置进行一定的改进才能实现高倍富集。为了分析实际复杂基质样品,需要探索新涂层、新装置、新模式等以使固相微萃取技术朝着便捷化、自动化的方向发展,更适合用于毛细管电泳的分析。
液相微萃取(liquid phase microextraction,LPME)是基于目标分析物在两液相介质间的分配平衡而实现萃取的,可将目标物浓缩至微升级的溶液内用于后续的分析检测。该方法克服了LLE有机溶剂消耗量大、富集倍数低等不足,目前常用的液相微萃取技术有单滴微萃取(SDME)、基于膜辅助液相微萃取(MS-LPME)、分散相液相微萃取(DLLME)和悬浮固化微滴萃取(SFODME)等。
SDME与CE联用分为离线与在线两种模式。离线模式是直接将萃取后的单滴抽回用于CE分析,此时接受相需要与毛细管电泳背景电解质匹配,三相单滴微萃取与CE的离线联用较简单,已有研究将三相单滴微萃取与CE联用,用于分析氟喹酮类药物[112]、氨根离子[113]、氰化物[114]等。2004年Chung课题组[115]首次将SDME与CE在线联用,在毛细管一端悬挂包裹一层辛醇的碱性微滴作为接受相,实现了从酸性介质中在线萃取荧光素,此过程通过仪器控制来实现,灵敏度提高了3个数量级,但这种萃取方式不稳定,液滴易脱落,且重现性差。该课题组[116]后续通过对毛细管进样端口进行改进以提高其稳定性,并设计了加载微搅拌器的在线单滴微萃取,将其用于伯胺药物[117]、有机酸[118]、氨基酸[119]及砷化物[120]等的分析,富集倍数均达上千。还有研究者结合新型溶剂如离子液体[121, 122]作为单滴萃取的有机相,使萃取快速达到平衡,此类两相单滴微萃取需要在非水毛细管电泳中才能实现有效分离。Xie等[123]对毛细管电泳样品瓶进行了细微的改进,采用在线顶空单滴微萃取与毛细管电泳联用实现对多种酚类物质的萃取,富集倍数高达520~1270。表2列出了SDME与CE在线联用的相关应用。
中空纤维液相微萃取(HF-LPME)分为两相模式和三相模式。在CE中,三相萃取模式应用较多,且多为离线操作,将萃取后的接受相抽回后用于CE分析。Lee等[131]在2003年设计了半自动化的中空纤维液-液-液微萃取(HF-LLLME),通过自动注射泵使微量进样针来回抽动,缩短了萃取的时间。HF-LLLME与CE联用已用于环境和生物样品中的无机汞和有机汞[77, 132]、芳香胺[133]、抗炎药[134]等的分析。Meng等[135]采用国产的中空纤维膜作为接受相支撑,集衍生化与萃取于一体,建立了顶空中空纤维膜液相微萃取毛细管电泳(HS-HF-LPME-CE)分析生物样品中的游离氰化物的新方法,为易挥发性物质的分析提供了新思路。由于中空纤维膜的特殊结构,难以与毛细管进样端相连,且萃取后存在记忆效应,使得HF-LPME不适合与CE在线联用,目前相关文献较少。Nozal等[136]与Xie等[137]分别在石英毛细管进样端中间引入一小段中空纤维膜,通过仪器控制整个萃取过程,自动化程度高,但前期装置制备与处理过程较复杂,影响实验重现性,文献中并未提及如何去除记忆效应。
目前电膜萃取与CE联用均是采用离线模式。Gjelstad等[138]将电膜萃取与CE联用直接分析未经处理的血浆和血液中的碱性药物,10 min即可完成整个萃取过程,且回收率较好,表明电膜萃取在复杂样品的分析方面具有其独特的优势。
此外,支撑式液膜(supported liquid membrane,SLM)萃取方式也应用较多,大多是采用支撑材料膜孔承载有机溶剂,将接受相与给予相分隔开来,分析物从给予相被萃取至接受相中实现萃取[139]。Pantuckova课题组[140]对CE样品瓶进行改进,设计了在线的SLM与CE联用的装置直接对生物样品进行分析。除此之外,Li等[141]设计了相转移膜辅助三相液相微萃取装置,使接受相液滴在萃取过程中更稳定,该法已成功应用于环境和生物样品中的汞形态分析,富集倍数高。基于膜辅助的液相微萃取技术模式多样,可根据目标物的相关性质以及仪器进样量等选择合适的液相微萃取方式,以达到净化样品基质,富集目标分析物的效果。
由于DLLME的样品溶液与萃取相的相比较大,萃取溶剂微滴分散于样品溶液中使得萃取相与水相接触面积非常大,因此能快速达到萃取动力学平衡,具有快速、简单、富集倍数高等优点。Li等[142]采用乙醇作为分散剂,氯苯作为萃取剂,建立了DLLME与CE联用用于分析水样中Hg2+的方法,在3 min内完成萃取,且富集倍数高达625。Yang等[143]采用DLLME与CE联用对水样中的汞进行形态分析(甲基汞、乙基汞、苯基汞、无机汞),富集倍数达46~547。由于分散相液相微萃取耐受基体干扰能力弱,因此在一定程度上限制了其实际应用范围,较多地被用于基质简单的样品分析中,如环境水样、尿液等。
除以上几种常用的液相微萃取外,浊点萃取也应用于与CE联用,具有简便、高效、成本低廉等优点。Wen等[144]采用双浊点萃取与CE联用对水样中的痕量酚类雌激素进行分析,富集倍数达到50~150。该法通常对萃取条件要求较严格,抗基体干扰能力较差。
微萃取技术具有净化样品基质能力强、富集倍数高等优点,是实际样品分析中有效的分离富集手段,经过微萃取后目标分析物被浓缩至微升级溶剂内,然而毛细管电泳常规的进样量为nL级,微升级萃取相往往无法完全进样,而毛细管电泳在柱富集技术在很大程度上提高了CE的进样量,具有改善检测灵敏度、选择模式众多、操作简便、自动化等优点。因此,采用毛细管电泳对复杂基质样品中的特定目标分析物进行分析时,可以根据目标分析物的性质,将合适的CE在柱富集技术与样品前处理中的微萃取技术有机结合,一方面两步富集所获得的富集倍数更高,同时也弥补了在柱富集技术抗干扰能力差的缺点;另一方面微升级萃取相能更大程度地被引入至在柱富集CE进行检测,这使得方法的灵敏度显著提高,且抗干扰能力显著增强。根据样品前处理技术的不同,此类双富集技术分为SPME-CE在柱富集技术与LPME-CE在柱富集技术两类。
固相微萃取与CE在柱富集技术的联用大多为离线模式,如将fiber-SPME、SBSE、CME与堆积联用技术用于复杂环境样品和生物样品的分析中。其中应用较多的是fiber-SPME与在柱富集的离线联用,由于搅拌棒吸附萃取的解吸体积与CE进样量不匹配,目前将其与在柱富集技术联用的相关报道较少。
Ravelo-Perez课题组将PDMS/DVB(divinylbenzene)涂层fiber-SPME与极性转换的大体积样品堆积(REPSM)联用,在胶束电动色谱模式下分别对白酒[145]与红酒[146]中的多种农药进行分析,这种联用技术具有较强的抗基体干扰能力,并显示出较高的富集倍数。Feng课题组将聚合物整体柱毛细管微萃取分别与毛细管电泳FASS[147]、FESI[148]联用,用于食品及生物样品分析,其检出限均在ppt(10-12)级。此外,Basheer等[149]将二羟基聚甲基丙烯酸甲酯聚合物涂覆在中空纤维膜上,将聚合物涂层中空纤维膜微萃取(PC-HFME)与CE常规堆积联用用于废水中氨基醇类的分析,该方法抗基体干扰能力强,灵敏度高。将两步富集技术自动化、便捷化可以提高实验的重现性,也与当今分析化学发展方向一致,已有研究者致力于发展在线固相微萃取技术与CE在柱富集技术相结合的新方法。Xia等[108]通过微泵控制毛细管两端液体的流向及流速,在内壁涂层毛细管内实现萃取、吹扫、分离等过程,并将所建立的方法用于血液中的药物分析中,经过双步富集后其检测灵敏度提高了2~3个数量级,为复杂样品的实时在线分析提供了新思路。
总体来说,由于固相微萃取不使用有机溶剂,与CE在柱富集技术联用较为简单,此类双富集技术可以使萃取相更大程度地进样,显著地提高了方法的灵敏度,同时也可以增强方法的抗基体干扰能力,使其可用于复杂样品的分析。
液相微萃取集萃取、富集于一体,具有操作简单、富集倍数高的优点,将其与CE在柱富集技术联用能大大提高CE-UV的检测灵敏度,目前已有多项研究将单滴微萃取、膜辅助液相微萃取、分散相液相微萃取与在柱富集技术联用,用于复杂样品分析。
目前单滴微萃取与CE在柱富集技术的联用均为在线联用模式,对于三相单滴微萃取,可直接将样品注入毛细管电泳进行后续的在柱富集与分离,而两相单滴微萃取则需采用非水毛细管电泳。Zhu等[61]将三相单滴微萃取与CE大体积样品堆积-吹扫联用,用于分析绿茶中的腺嘌呤,尽管该萃取为静态萃取,但经过60 min萃取及后续在柱富集步骤,将整个方法的灵敏度提高了3个数量级。Choi等[118]采用非水毛细管电泳将两相单滴微萃取与大体积样品堆积在线联用用于分析苯酚类化合物,对5种苯酚的富集高达 7000 倍。单滴微萃取与CE在柱富集技术的在线联用相比其他液相微萃取较易实现,但其稳定性与重现性较差,且对仪器操作者的要求较高。
基于膜辅助的液相微萃取相比单滴微萃取更稳定。Lee等[150]将中空纤维膜三相液相微萃取与MEKC场放大进样联用,用于环境样品中的酚类物质的分析,富集倍数为904~2692。Li等[151]自主设计了膜辅助液液液三相微萃取装置,将其与CE大体积样品堆积联用,分析生物与环境样品中的汞形态,其富集倍数高达 12138,该方法的抗基体干扰能力强。分散相液相微萃取相比其他液相微萃取技术具有操作简便快速、富集倍数高等优点,但由于其接受相为有机相,与常规的CE进样不匹配,通常需要将目标分析物用水相重溶后进样,采用在柱富集可以使重溶后的目标分析物更大程度地进样,提高了方法的灵敏度。Zhang等[152]将分散相液相微萃取与MEKC吹扫富集结合分析黄瓜中的新烟碱类杀虫剂,萃取后将萃取剂吹干,采用20μ L硼酸溶液对其进行重溶,后续结合SDS吹扫富集,增大了进样量,此方法的富集倍数为 4000~10000。此外,该课题组[153]还发展了将分散相固相微萃取与分散相液相微萃取结合的新型萃取技术与吹扫联用的新方法,首先以C18作为吸附剂对土壤样品提取物进行纯化,随后再经过分散相液相微萃取对其中的磺酰脲类除草剂进行萃取,这种方式克服了分散相液相微萃取耐受基体干扰能力差的缺点,将其与MEKC吹扫富集法联用,最终所建立的方法富集倍数在 3000~5000 之间。
由上述可知,将液相微萃取与CE在柱富集技术联用通常需要考虑接受相与CE进样是否匹配的问题。对于两相液相微萃取需要对样品重溶或者采用非水毛细管电泳进行分析;对于三相液相微萃取可以直接进入CE分析,通常液相微萃取的萃取相体积为微升级,远大于常规进样量,将其与在柱富集技术联用可以进一步提高方法的富集倍数,以满足复杂样品对分析方法灵敏度的要求。
结合双富集技术的优点,目前已有许多研究者发展了多种微萃取技术与CE在柱富集技术联用的新方法,并将其成功应用于环境、食品、生物等领域(见表3)。
高效毛细管电泳分析法具有分离效率高、分析快速、成本低廉、样品消耗量少等优点,其常用的检测器有紫外检测器与激光诱导荧光检测器。激光诱导荧光检测器的检测灵敏度较高,但其仪器价格昂贵,且通常需要对样品进行衍生化才可以进行检测;紫外检测器是普适性的检测器,由于毛细管内样品体积小且柱上检测光程短,紫外检测灵敏度不是很高,无法满足实际样品中目标分析物直接分析的要求。为了解决上述实际分析中存在的问题,可以采用样品前处理技术预先去除复杂基质,选择性富集目标物,使目标物的存在形式与仪器进样相匹配;采用毛细管电泳在柱富集技术对富集后的微量样品进行最大化进样,也可以提高整个方法的灵敏度;或将两种方式有机地结合在一起,进一步提高富集倍数,拓宽毛细管电泳在实际样品分析中的应用领域。