Acquity UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司); Elix/Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); Allegra X-22R冷冻离心机(美国Beckman公司); Promax 2020往复式摇床(德国Heidolph公司); N-EVAP-24氮吹浓缩装置(美国Organomation公司); MS3漩涡混合器(德国IKE公司); Heaion C₁₈固相萃取柱(500 mg/3 mL,天津市贺世科技发展有限公司)、24位固相萃取装置(德国CNW公司)、BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),水相0.22 μ m聚醚砜微孔滤膜(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

标准物质和同位素内标:17 β -雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇(德国Dr. Ehrenstorfer公司); ¹³C₂-17 β -雌二醇 (纯度99% ,美国CIL公司)。

试剂:甲醇(色谱纯,韩国SK公司);乙腈(色谱纯,Sigma公司);甲醇、氨水(分析纯,重庆市川东化工有限公司);乙腈(分析纯,成都市科龙化工试剂厂)。

样品:随机购买市售预混合饲料、配合饲料、浓缩饲料各10份,每份为1 kg。

实验用水均为超纯水。

标准储备液的配制:分别准确称取适量的标准品,用甲醇溶解并定容,配制成100 mg/L 的标准储备液,于4 ℃下保存。使用时,用甲醇逐级稀释成混合标准中间液,现用现配。

基质匹配标准曲线:称取不含3种待测物的饲料样品,按1.3节方法操作,得到空白基质溶液。用空白基质溶液稀释标准溶液配制成一系列混合基质标准工作溶液,现用现配。

准确称取混合均匀的饲料样品5 g(精确到0.1 mg)于250 mL具塞三角玻璃瓶中,准确加入适量内标和25 mL乙腈,140 r/min 振荡提取30 min,5000 r/min 离心5 min。取上清液2 mL,并加入6 mL超纯水稀释,混匀后通过Heaion C₁₈固相萃取小柱(经6 mL甲醇和6 mL超纯水预活化),保持流速约为1 mL/min,然后用3 mL超纯水淋洗小柱。待淋洗液流尽,减压抽干,用4 mL甲醇洗脱,收集洗脱液在(50±1) ℃下氮气吹干,加入1 mL含30%(v/v)乙腈的水溶液溶解残留物,溶液经0.22 μ m聚醚砜微孔滤膜过滤,滤液上机测定。

色谱条件:ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m,美国Waters公司);柱温40 ℃,流速0.3 mL/min;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%氨水溶液;进样量为5 μ L;梯度洗脱程序为:0～0.2 min,40%A; 0.2～3.0 min,40%A～90%A; 3.0～4.5 min,90%A～40%A; 4.5～5.0 min,40%A。

质谱条件:电喷雾电离源(ESI);正离子(分析苯甲酸雌二醇)和负离子(分析17 β -雌二醇、戊酸雌二醇、¹³C₂-17 β -雌二醇内标)模式;毛细管电压:正离子模式3.5 kV,负离子模式-2.9 kV;脱溶剂气温度:260 ℃;脱溶剂气流速:600 L/h;多反应监测(MRM)模式检测。

由于电喷雾质谱的电离过程是在溶液状态下进行,因此流动相的组成除了影响保留时间和峰形外,还会对离子化效率产生影响,最终影响目标化合物的检测灵敏度。同时一些常用的流动相物质如甲酸、乙酸为质子给予体,体积分数要求低于1% ;缓冲盐乙酸铵、甲酸铵浓度要求低于10 mmol/L,所以本实验分别采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-0.1 mmol/L 甲酸铵、乙腈-0.1 mmol/L 甲酸铵、甲醇-0.1%(v/v)氨水、乙腈-0.1%(v/v)氨水作为流动相,考察各流动相体系对于3种雌激素分离测定的影响。结果表明,采用乙腈-0.1%氨水作为流动相,同时结合梯度洗脱程序缩短洗脱时间能得到较好分离,且3种雌激素在质谱上的响应均较高。图1为混合标准溶液中3种雌激素和内标的二级质谱提取离子流图。

图1

Fig. 1

图1 3种雌激素和内标的二级质谱提取离子流图 Fig.1 MS/MS extraction ion spectra of the three exogenous hormones and the internal standard

分别配制3种雌激素质量浓度为10 μ g/L 的标准溶液,采用针泵进样方式直接进行质谱条件的优化。在MS/MS状态下,以全扫描的方式观察3种雌激素的总离子流图, 选择适当的准分子离子作为母离子, 并优化母离子和子离子的锥孔电压和碰撞能量,得到各物质的质谱采集参数信息见表1。结果表明,选择[M-H]^-作为17 β -雌二醇、戊酸雌二醇、¹³C₂-17 β -雌二醇的母离子,[M+H]⁺作为苯甲酸雌二醇的母离子时,3种雌激素的响应值最高。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 多反应监测(MRM)质谱采集参数 Table 1 LMS acquisition parameters for multiple reaction monitoring (MRM) Estrogen Retention time/min Precursor ion Quantitative and qualitative ion pairs (m/z) Cone voltage/V Collision voltage/V 17β-Estradiol 1.26 [M-H]- 271.4/145.0 60 32 271.4/183.1* 34 Estradiol benzoate 3.02 [M+H]+ 377.4/105.0* 35 15 377.4/135.1 12 Estradiol valerate 3.23 [M-H]- 355.4/101.0* 55 27 355.4/253.3 25 13C2-17β-Estradiol 1.25 [M-H]- 273.4/185.1* 55 32 273.4/147.1 37 * Quantitative ion pair.

表1 多反应监测(MRM)质谱采集参数 Table 1 MS acquisition parameters for multiple reaction monitoring (MRM)

基质是指样品中除分析物以外的一切组分,主要来源于样品中内源性组分和样品处理后引入的杂质。基质对分析物测定的影响即为基质效应,可影响线性关系、检出限(LOD)、定量限(LOQ)等。采用标准曲线法考察了饲料样品对待测物的基质效应。实验结果表明,基质校准曲线的斜率比纯溶剂标准曲线的斜率小,即存在基质抑制效应。在样品中加入同位素内标对待测组分的提取和测定无任何干扰,且受基质成分的影响也极为相似。同位素内标不但可抵消质谱离子化时的基质效应,还可消除样品前处理过程中的差异。因此,为最大限度地消除基质效应干扰,本研究采用基质匹配标准曲线和¹³C₂-17 β -雌二醇同位素内标进行定量,可得到3种雌激素的准确可靠结果。

称取一定量的预混合、配合和浓缩饲料的空白样品于250 mL具塞三角玻璃瓶中,准确加入25 mL乙腈,按照1.3节操作处理样品,得到空白基质溶液。用空白基质溶液稀释混合标准工作液,再加入适量的内标标准溶液,配制成17 β -雌二醇、苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇质量浓度均为5、10、20、40、60、80、200 μ g/L 的基质混合标准工作液,以对应的基质加标溶液浓度与内标溶液浓度比值为横坐标X,相应的待测物峰面积与内标物峰面积为纵坐标Y,绘制3种雌二醇的内标校准曲线。以3倍信噪比(S/N=3)确定仪器的检出限,以10倍信噪比(S/N=10)确定仪器的定量限,结果见表2。结果表明,该方法检测3种雌激素的线性范围宽,工作曲线线性良好,17 β -雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的检出限分别为7、5和7 μ g/kg;定量限分别为20、14和20 μ g/kg,适用于饲料中3种雌激素的测定。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 3种雌激素的检出限、定量限、线性方程及相关系数 Table 2 Limits of detection,limits of quantification,regression equations and correlation coefficients (r) of the three estrogens Estrogen LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) Regression equation Linear range/(μg/L) r 17β-Estradiol 7 20 Y=0.267X-0.088 10-200 0.999 Estradiol benzoate 5 14 Y=0.905X-0.020 5-200 0.999 Estradiol valerate 7 20 Y=1.506X-1.380 10-200 0.996 Y: peak area ratio of the estrogen compound to the internal standard; X: concentration ratio of the estrogen compound to the internal standard.

表2 3种雌激素的检出限、定量限、线性方程及相关系数 Table 2 Limits of detection,limits of quantification,regression equations and correlation coefficients (r) of the three estrogens

在空白样品中分别添加20、40、100、200 μ g/kg 4个水平的混合标准液进行测定,以基质匹配标准曲线内标校准。按照1.3节进行样品处理,UPLC-MS/MS测定,每个添加水平样品重复测定6次,分别计算回收率,结果见表3。结果表明:17 β -雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇在预混合、配合和浓缩饲料中的平均回收率分别为96.5% ～100.5% 、97.2% ～102.0%和96.9% ～100.3% 。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 3种饲料样品中3种雌激素的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the three estrogens spiked in three feed samples (n=6) Sample Spiked/(μg/kg) 17β-Estradiol Recovery/% RSD/% Estradiol benzoate Recovery/% RSD/% Estradiol valerate Recovery/% RSD/% Premixed feed 20 100.5 1.2 102.0 0.5 99.5 1.5 40 98.1 0.9 99.1 0.7 97.4 0.9 100 99.3 1.1 99.0 0.6 99.4 1.3 200 99.6 0.8 99.8 0.5 99.2 1.2 Compound feed 20 96.5 2.4 97.2 1.0 96.9 1.4 40 97.2 1.0 99.1 0.9 98.5 1.7 100 99.0 0.8 98.9 1.2 98.3 1.5 200 99.1 1.2 99.6 0.9 99.2 0.9 Concentrated feed 20 97.6 2.9 98.5 1.3 97.9 1.1 40 98.5 1.9 98.4 0.6 99.1 0.7 100 97.8 1.4 99.6 1.0 99.8 0.8 200 99.9 1.5 98.7 0.9 100.3 0.4

表3 3种饲料样品中3种雌激素的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the three estrogens spiked in three feed samples (n=6)

在样品中分别添加20、100、150 μ g/kg 3个水平的混合标准溶液,按照1.3节中所述方法处理样品,每个添加水平各7份平行样,分别于同一天内连续测定,计算日内精密度,并连续测定5天,计算日间精密度。结果显示:在预混合、配合和浓缩饲料中17 β -雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的日内精密度为1.0% ～8.7% ,日间精密度为1.4% ～11.5% 。

利用该方法测定了市场上购买的30份饲料样品(预混合饲料、配合饲料、浓缩饲料各10份),每个样品做3个平行测定。经检测,30份样品均未检出目标化合物。