色谱  2014, Vol. 32 Issue (12): 1340-1348   PDF (883 KB)    
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满正印
王全林
李和生
张爱芝
超高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定美术颜料中33种游离态初级芳香胺
满正印1,2, 王全林2 , 李和生1, 张爱芝2    
1. 宁波大学海洋学院, 浙江 宁波 315211;
2. 宁波市产品质量监督检验研究院 国家文教用品质量监督检验中心, 浙江 宁波 315048
收稿日期：2014-7-30
基金项目：科技部质检公益性行业科研专项(2012104018-15);浙江省质监科研计划项目(20140240).
通讯作者：王全林,E-mail:quanlinwang@163.com.
摘要：建立了超高效液相色谱-三重四极杆质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定水粉画颜料、油画颜料、丙烯画颜料等美术颜料中33种初级芳香胺(PAAs)的检测方法。样品中的初级芳香胺用乙腈提取,经离心分离、氮吹浓缩后,以甲醇-水(1:9, v/v)定容至2 mL, 0.22 μm膜过滤后上机检测。采用BEH Phenyl柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),以含0.07%(v/v)甲酸的甲醇溶液-水(1:9, v/v)为流动相,梯度洗脱分离,UPLC-MS/MS多反应监测模式(MRM)检测,同位素内标法定量。方法优化了色谱分离条件、质谱碎裂电压、碰撞能量等,并考察了提取时间、提取溶剂、浓缩方式等对回收率的影响。33种初级芳香胺的方法检出限为5~50 μg/kg,定量限为15~150 μg/kg, 3种不同基质样品在3个添加水平的平均回收率为70.1%~115.8%,相对标准偏差(RSD)为2.1%~15%。本方法操作简便、快速、准确、灵敏度高,能满足相关测定的要求。
关键词： 超高效液相色谱-三重四极杆质谱法     初级芳香胺     美术颜料    
Simultaneous determination of 33 primary aromatic amines of free state in fine pigments by ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry
MAN Zhengyin1,2, WANG Quanlin2 , LI Hesheng1, ZHANG Aizhi2    
1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China;
2. National Supervision and Inspection Center of Stationery and Education Products Quality, Ningbo Academy of Product Quality Supervision and Inspection, Ningbo 315048, China
Received: 2014-7-30
Abstract: A comprehensive analytical method based on ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS) has been developed for the simultaneous determination of 33 primary aromatic amines (PAAs) in fine pigments such as gouache paint, oil painting pigment and acrylic paint. The primary aromatic amines in samples were extracted with acetonitrile. Then the extract was concentrated by centrifugation and nitrogen blow, finally diluted to 2 mL with methanol-water (1:9, v/v) and filtered through 0.22 μm membrane before UPLC-MS/MS analysis. The analytes were separated on a BEH Phenyl column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) with 0.07% (v/v) formic acid in methanol-water as mobile phases in gradient elution. The PAAs were detected by UPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring (MRM) mode and quantified by the internal standard method. The separation conditions, fragment voltages and collision energies were optimized. The impacts of extraction times, extraction solvents and concentration methods on recoveries were studied. The limits of detection and limits of quantitation for the 33 primary aromatic amines were 5-50 μg/kg and 15-150 μg/kg respectively. The mean recoveries of three different dye products at three spiked levels were 70.1%-115.8%. The relative standard deviations were 2.1%-15%. The experimental results indicated that the method is simple, rapid, sensitive, accurate and can meet the requirements for the determination.
Key words: ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     primary aromatic amines (PAAs)     fine pigments    

初级芳香胺(PAAs)是一类毒性较强的致癌物质,可通过皮肤、胃肠道和呼吸道进入人体,进而引发人体输尿管癌、肾癌、膀胱癌等恶性疾病。为此,欧盟、美国等国家相继对生产、制造、销售偶氮染料、纺织品、玩具、电器等产品中的芳香胺含量做了法律规定,欧洲议会和欧洲联盟委员会在公布的2002/61/EC与2003/3/EC指令中,规定了多种特定芳香胺为受限制的危险物质,并且禁止销售能产生禁用芳香胺的商品[1]。我国也对食品接触材料[2]、染料产品[3]、纺织品[4]、卷烟[5]等商品中初级芳香胺的限量或迁移量测定制定了相应的检测标准。油画颜料、水粉画颜料、丙烯画颜料等美术用品作为人们熟知的美术颜料,在学生、绘画爱好者等人群中得到了广泛应用,但由于原料加工、生产工艺控制等方面的原因,使得PAAs在这些美术颜料中有一定残留,由此为学生、绘画爱好者的健康带来隐患。

目前,已明确其结构、特性的PAAs大约有30余种,其中关于PAAs的检测方法主要有离子色谱法[6]、液相色谱法[2, 4, 7, 8, 9]、气相色谱-串联质谱法[3, 5, 10]和液相色谱-串联质谱法[1, 11, 12, 13],但已报道的这些方法主要集中在纺织品、食品接触材料、染料、电器、水等方面,且检测的PAAs种类有限,还未见关于水粉画颜料、油画颜料、丙烯画颜料等美术颜料中PAAs的多组分同时检测的研究报道。本文采用同位素内标法,建立了美术颜料中33种游离PAAs多组分同时测定的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。经过对实际样品的检测,获得了满意的结果,对提高水粉画颜料、油画颜料、丙烯画颜料的产品质量,保障消费者身体健康具有重要意义。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

ACQUITY/Quattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司);超声波水浴锅(KS-300EI,宁波海曙科生超声设备公司);高速离心机(TG16-WS,上海卢湘仪离心机仪器有限公司);氮吹仪(DC-12,上海安谱仪器公司)。

甲醇(色谱纯,Merck公司),甲酸(色谱纯,Acros Organics公司),其他试剂均为分析纯;实验用水均为超纯水(Millipore公司超纯水器制备,电阻率为18.2 M Ω \5cm)。

33种初级芳香胺标准品和3种氘代初级芳香胺内标物(纯度均大于98% )购自Dr. Ehrenstorfer公司，详见表1。

标准储备液的配制:取10 mg/L 的氘代4-氨基联苯(4-aminobiphenyl-d9,4-ABP-d9)标准溶液于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至1 mg/L;其余的PAAs标准品和氘代内标物则分别称取10.0 mg,用甲醇溶解后转移至10 mL棕色容量瓶中,以甲醇定容得1 g/L 的单标准储备液。其中苯胺(ANL)标准储备液于-18 ℃保存,其他标准储备液于4 ℃保存。混合标准工作溶液的配制:以10%(v/v)甲醇水溶液配制不同浓度的PAAs混合标准工作液,每一标准工作液中3种氘代内标物的质量浓度均为25 μ g/L。

表1 PAAs名称、CAS号、保留时间及质谱参数 Table 1 Names,CAS numbers,retention times and optimized parameters for PAAs
1.2 样品前处理方法

水粉画颜料:称取0.2 g样品(精确到0.001 g)于10 mL聚丙烯离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋混匀后超声提取20 min,以 10 000 r/min 离心5 min,上清液转至10 mL玻璃离心管中,于40 ℃用氮气吹至近干(约0.2 mL),用10%甲醇水溶液定容至2 mL,移入1.5 mL离心管中,以 10 000 r/min 离心5 min,过0.22 μ m滤膜,待测。

油画颜料:称取0.2 g样品(精确到0.001 g)于10 mL玻璃离心管中,加入1 mL乙腈和3 mL乙腈饱和的正己烷,摇匀后超声5 min,离心后弃去上清液,补加9 mL乙腈,涡旋混匀后超声提取20 min,以 2 000 r/min 离心5 min,上清液转至10 mL玻璃离心管中,于40 ℃用氮气吹至近干(约0.2 mL),用10%甲醇水溶液定容至2 mL,移入1.5 mL离心管中,以 10 000 r/min 离心5 min,过0.22 μ m滤膜,待测。

丙烯画颜料:称取0.2 g样品(精确到0.001 g)于10 mL玻璃离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋混匀后超声提取20 min,加入0.2 mL 1 mol/L 的盐酸溶液,以 2 000 r/min 离心2 min,上清液转至10 mL玻璃离心管中,于40 ℃用氮气吹至近干(约0.2 mL),加1 mL 10%甲醇水溶液、0.2 mL 1 mol/L 的氢氧化钠溶液,用10%甲醇水溶液定容至2 mL,移入1.5 mL离心管中,以 10 000 r/min 离心5 min,过0.22 μ m滤膜,待测。

1.3 UPLC-MS/MS分析条件

超高效液相色谱条件 色谱柱:BEH Phenyl柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m);柱温:40 ℃;流速:0.20 mL/min;样品温度:20 ℃;进样体积:10 μ L。流动相A为含0.07%(v/v)甲酸的甲醇溶液,流动相B为水。流动相梯度洗脱程序:0～5.0 min,10%A; 5.0～7.5 min,10%A～55%A; 7.5～12.5 min,55%A～85%A; 12.5～13.0 min,85%A～10%A; 13.0～16.5 min,10%A。

质谱条件 离子源:电喷雾电离(ESI+);毛细管电压:3.00 kV;射频透镜1(RF lens 1)和射频透镜2(RF lens 2)的电压分别为15.0 V和13.0 V;离子源温度:100 ℃;脱溶剂温度:350 ℃;脱溶剂气流量:600 L/h。采用多反应离子监测(MRM)模式,各种PAAs优化采集参数见表1。采取多通道选择离子方式,通道1选择PAAs为间苯二胺(m-PDA)、1,5-二氨基萘(DANP)、对-氯苯胺(4-CA)、间氯苯胺(3-CA)、邻氨基偶氮甲苯(o-ANT)、4-氯-邻-甲苯胺(4-COT)、4-ABP-d9、4-氨基联苯(4-ABP)、2-氨基联苯(2-ABP)、4,4′-亚甲基双(2-氯苯胺)、(4,4′-MB-2-CA),通道2为2,6-二氨基甲苯(2,6-TDA)、2,4-甲苯二胺(2,4-TDA)、对甲氧基苯胺(p-ASD)、邻氨基苯甲醚(o-ASD)、4,4′-二氨基二苯醚(4,4′-ODA)、4,4′-亚甲基二苯胺(4,4′-MDA)、邻联甲苯胺(o-TLD)、4,4′-亚甲基-二-邻-甲苯胺(4,4′-MDOT)、2-氨基-5-硝基苯胺(2-M-5-NT),通道3为2,4-DAA、对甲苯胺(p-TOL)、邻甲苯胺(o-TOL)、2,6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、2,4-二甲基苯胺(2,4-DMA)、2-萘胺(2-NAP)、3,3′-二氯联苯胺(3,3′-DCB)、4,4′-二氨基二苯硫醚(4,4′-THOA)、邻甲苯胺-d9(o-TOL-d9),通道4为苯胺(ANL)、联苯胺(BNZ)、2-甲氧基-5-甲基苯胺(2-M-5-MA)、3,3′-二甲氧基联苯胺(3,3′-DMB)、2,4,5′-三甲基苯胺(2,4,5′-TMA)、3,4-二氯苯胺(3,4-DCA)、3,5-二氯苯胺(3,5-DCA)、苯胺-d5(ANL-d5)。

2 结果与讨论
2.1 提取溶剂和超声提取方法的选择

PAAs易溶于甲醇、乙腈等溶剂,为选择有效的提取溶剂,我们比较了甲醇、乙腈等溶剂对美术颜料中PAAs的提取效果，通过实验发现,用乙腈作为提取溶剂,90%目标化合物的回收率在80% ～110%之间,提取效果优于甲醇。尤其是易挥发性的2,4-DAA,用乙腈作提取剂时的回收率在80%左右,而用甲醇作提取剂的回收率不足65% 。另外,为保证样品中的PAAs能够得到充分的提取,我们考察了超声提取时间分别为10、15、20、25、30、40、50 min对PAAs提取率的影响,结果(见图1)显示33种目标化合物中多数化合物在20 min时的回收率最高,因此选择超声提取时间为20 min。此外,我们还比较了提取剂用量及提取次数对PAAs提取效果的影响,实验发现,提取剂用量为10 mL时就可以将初级样品中的PAAs有效提出,并且一次提取与重复提取的效果相差不明显。为此,我们最终确定提取方式为10 mL乙腈一次性提取20 min。

图1 提取时间对33种待测物回收率的影响 Fig.1 Effects of the extraction time on recoveries of the 33 compounds
2.2 样品净化方法的选择

美术颜料中含有染料、油、凡士林、矿物质等,这些物质不仅会影响PAAs的检测,而且一些大分子物质易造成仪器管路的堵塞,因此需要选择有效的样品净化方法。目前颜料产品最常用的净化方法是固相萃取法,可以有效去除颜料中的具色物、油等干扰物质,但这种方法操作相对复杂,而且购买固相萃取柱无形之中增加了检测成本,不利于检测方法的普及。我们在实验中发现,水粉画颜料可以直接被乙腈、甲醇等有机溶剂分散,且目标物通过高速离心及过膜的方式就可以得到有效提取和净化。而油画颜料含有油成分,样品在提取过程中无法被乙腈分散,为此,我们先用乙腈饱和的正己烷将样品溶解,离心后再用乙腈提取,这样不仅可以用乙腈将目标物提取,而且还可以有效去除样品中的油性干扰物。对于丙烯画颜料,由于其基质中含有丙烯酸乳胶,通过高速离心的方式无法完全净化,而且,丙烯画颜料遇酸后会产生酸沉淀,如果净化不完全,在仪器中遇到甲酸会产生沉淀而造成色谱柱的堵塞;为此,我们在丙烯画颜料样品净化过程中加入盐酸使基质沉淀,在上机前用氢氧化钠中和,得到了很好的净化效果。通过上述样品净化方法,可以有效降低杂质对PAAs检测的干扰。

2.3 浓缩富集方式的选择

浓缩富集是样品前处理的重要步骤,目前常用的有旋转蒸发和氮气吹干两种方法,本实验比较了旋转蒸发和氮气吹干对PAAs提取效果的影响。结果显示,两种不同浓缩方式对大部分目标物的富集效果相差不明显,但采用旋转蒸发方式浓缩时2,4-DAA等目标物的回收率不足50% ,而采用氮气吹干的方式可使所有目标物的回收率在75% ～113%之间。原因或许是2,4-DAA等目标物为易挥发性PAAs,使得其在旋转蒸发过程中发生挥发损失。而氮气吹干可有效解决2,4-DAA等易挥发性PAAs回收率过低的问题。另外,在氮气吹干过程中,由于部分PAAs的易挥发性,应将样液氮吹至近干,如果将样液吹干会严重降低部分PAAs的提取效果。我们在实验过程中将样液浓缩至约0.2 mL,这样就可以保证PAAs在氮吹过程中不会因吹干而损失。

2.4 UPLC-MS条件的优化
2.4.1 色谱柱对分离效果的影响

本研究分析的33种PAAs混合物中有多种结构和性质相似的同分异构体,虽然MRM模式不需要所有峰都得到基线分离,但这些同分异构体的母离子和子离子相近,其基线需要完全分离。因此,选择一根分离效果较好的色谱柱是本研究的关键。我们比较了Waters公司生产的ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)、ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)、ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)等色谱柱对33种PAAs和3种氘代内标物的分离效果,3种色谱柱均可以较好地分离PAAs,但C18柱和T3柱的保留时间过短,且峰形较差,其原因在于C18柱和T3柱只是在反相UPLC条件下分离和保留极性有机化合物,对于极性较强的PAAs没有较好的保留和分离;而Phenyl(苯基)柱具有能形成p-p共轭相互作用的能力,对一些极性芳香族化合物的保留能力比C18柱和T3柱强。且苯基柱对结构中含有苯环的化合物的保留具有选择性,可改变PAAs的保留时间,更有利于PAAs的分离。因此,最终选择ACQUITY UPLC BEH Phenyl(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)作为本实验的分离柱,33种PAAs和3种氘代内标物的保留时间见表1。

2.4.2 流动相对分离效果的影响

以ACQUITY UPLC BEH Phenyl为色谱柱,考察了不同配比的甲醇-水、乙腈-水等流动相体系对PAAs的分离效果,结果表明,乙腈在苯基柱中洗脱PAAs的能力强于甲醇。另外,在质谱条件优化过程中发现,3,4-DCA、3,5-DCA等PAAs的响应信号低,但通过添加适量酸可以增强其响应信号。为此,我们在上述流动相体系的有机相和水相中分别添加不同浓度的甲酸,比较了不同流动相体系对色谱柱分离效果的影响,试验发现,甲酸不仅可以增强部分PAAs的信号强度,而且还增强流动相的洗脱能力,缩短PAAs的保留时间。为保证所有PAAs能够在最短时间内得到最好的分离效果,并综合考虑流动相的洗脱能力及对部分PAAs信号强度的影响,最终确定以含0.07%(v/v)甲酸的甲醇-水溶液为流动相。

以含0.07%甲酸的甲醇-水溶液为流动相,进一步优化梯度洗脱程序,最终确定梯度洗脱程序见1.3节,在此条件下,33种PAAs可在13 min内得到较好的分离,200 μ g/L PAAs混合标准溶液的MRM色谱图见图2。

图2 33种PAAs的总离子色谱图 Fig.2 Total ion chromatograms of the 33 PAAs The peak numbers are the same as in Table 1.
2.4.3 质谱条件的选择

为确定PAAs的母离子和子离子,我们用10% (v/v)甲醇水溶液配制1 mg/L 单标准工作液,采用流动注射泵连续进单标准工作液的方式,选择ESI正离子扫描模式对每一种PAAs进行全扫描,通过全扫描质谱图
确定33种PAAs及3种氘代品的准分子离子峰[M+H]+。以[M+H]+为母离子,进一步确定母离子丰度较强时的锥孔电压;然后采用子离子扫描方式,选取丰度较强的特征碎片离子分别作为定量离子和定性离子,优化碰撞能量,最终确定MRM方法。33种PAAs和3种氘代内标物相应的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞电压见表1。

2.5 标准曲线、方法检出限和定量限

取质量浓度为1～200 μ g/L 的PAAs混合标准工作液,按照选定的最优分析条件进行测定,以峰面积/内标峰面积×内标浓度(Y)为纵坐标,标准溶液质量浓度(X,μ g/L)为横坐标绘制标准工作曲线。结果表明:33种PAAs的线性范围为1～200 μ g/L,且X和Y具有良好的线性关系,相关系数(r)＞0.99。

以阴性样品为检测对象,添加不同浓度的PAAs混合标准溶液,按照S/N=3计算检出限(LOD),按照S/N=10计算定量限(LOQ)。本方法检出限在5～50 μ g/kg 之间,定量限在15～150 μ g/kg 之间。33种PAAs的线性方程、相关系数、方法检出限及定量限见表2。

表2 33种PAAs的线性方程、相关系数、方法检出限及定量限 Table 2 Linear equations,correlation coefficients (r),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) for the 33 PAAs
2.6 回收率和精密度

采用样品加标的方式对水粉画颜料、油画颜料、丙烯画颜料等阴性样品进行回收率和精密度试验,根据不同PAAs的稳定性和相应信号强度,添加3个不同浓度水平,按照本方法所确定的实验条件,对每个浓度水平进行6次平行试验,33种PAAs的加标回收率在70.1% ～115.8%之间,相对标准偏差(RSD)在2.1% ～15%之间,具体回收率和精密度结果见表3。

表3 33种PAAs的回收率和相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for the 33 PAAs (n=6)
2.7 实际样品的测定

采用此方法对15款市售水粉画颜料、油画颜料、丙烯画颜料等美术颜料进行测定,检测出1款绿色水粉画颜料样品中含有苯胺,平均含量为69 μ g/kg,RSD(n=6)为0.12% 。阳性样品的色谱图见图3。

图3 实际样品中苯胺的色谱图 Fig.3 MRM chromatograms of ANL in a paint sample
3 结论

本研究建立了同时检测水粉画颜料、油画颜料、丙烯画颜料等美术颜料中33种PAAs的UPLC-MS/MS检测方法。采用ACQUITY UPLC BEH Phenyl色谱柱,以含0.07%(v/v)甲酸甲醇-水溶液为流动相,在ESI+模式下以MRM方式进行检测,可同时完成目标物的定性定量分析。本方法前处理过程简单,可有效去除基质中杂质的干扰,具有灵敏度高、检测效率高、简便快捷等特点,各项指标均可满足美术颜料中PAAs的检测要求。

参考文献
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