高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定乳粉中的低聚果糖


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耿丽娟^1,2, 黄峻榕¹ , 冯峰², 蒋萍萍², 储晓刚², 张峰² , 凌云²

1. 陕西科技大学生命科学与工程学院, 陕西西安 710021;
2. 中国检验检疫科学研究院, 食品安全研究所, 北京 100123

收稿日期：2014-7-31

基金项目：质检总局公益性行业科研专项项目(2012104002);质检总局科技计划项目(2013IK198);国家软科学研究计划项目(2010GXS5B153).

通讯作者：黄峻榕,E-mail:huangjunrong2000@163.com;张峰,E-mail:fengzhang@126.com

摘要：建立了测定乳粉中低聚果糖的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)方法。样品经50%(v/v)乙醇水溶液提取,On Guard RP柱除脂,CarboPac PA200阴离子交换色谱柱(250 mm×3 mm)分离。采用水、0.2 mol/L NaOH溶液和0.4 mol/L NaAc溶液三元梯度淋洗,流速为0.4 mL/min,柱温为30 ℃,进样量为25 μL,脉冲安培检测器检测。蔗果三糖、四糖、五糖在0.05~10 mg/L范围内线性关系良好,相关系数(r²)> 0.9993;定量限分别为0.02、0.005和0.02 mg/L。在0.5、1.0、5.0 mg/L添加水平下,蔗果三糖、四糖、五糖的平均回收率为86.0%~114.0%。该方法处理简单、结果准确、灵敏度高,适用于乳粉中低聚果糖的测定。

关键词：高效阴离子交换色谱脉冲安培检测低聚果糖乳粉

Determination of fructooligosaccharides in milk powder using high performance anion-exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection

GENG Lijuan^1,2, HUANG Junrong¹ , FENG Feng², JIANG Pingping², CHU Xiaogang², ZHANG Feng² , LING Yun²

1. College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi'an 710021, China;
2. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China

Received: 2014-7-31

Abstract: Fructooligosaccharides (FOS) are usually added in milk powder as a kind of prebiotic. Thus, quantitative analysis of the FOS is very important for the quality control of milk powder. In this study, a simple method for the simultaneous determination of three FOS components with degrees of polymerization (DP) 3-5 in milk powder was developed by high performance anion-exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). The samples were extracted with 50%(v/v) ethanol aqueous solution and defatted by an On Guard RP pretreatment column. The separation was performed on a CarboPac PA200 column by gradient elution using deionized water, 0.2 mol/L NaOH solution and 0.4 mol/L NaAc solution as the mobile phases. The flow rate was 0.4 mL/min. The column temperature was 30 ℃; and the injection volume was 25 μL. Good linear response was observed in the concentration range of 0.05-10 mg/L (r²>0.9993). The limits of quantification were 0.02, 0.005 and 0.02 mg/L for 1-kestose, nystose and fructofuranosyl-nystose, respectively. The mean recoveries varied from 86.0% to 114.0% at three spiked levels of 0.5, 1.0 and 5.0 mg/L. The short-chain fructooligosaccharides from inulooligosaccharides (IOS) were successfully separated by the developed HPAEC-PAD method. The method is simple, accurate, sensitive, and helpful for the quality control of milk powder.

Key words: high performance anion-exchange chromatography (HPAEC) pulsed amperometric detection (PAD) fructooligosaccharides (FOS) milk powder

低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS),又名寡果糖或蔗果低聚糖,是果糖基经 β (2→1)糖苷键连接而成的聚合度(DP)为2～9的功能性低聚糖^[1]。研究表明,低聚果糖能迅速促进肠道内双歧杆菌等益生菌的增殖,改善肠道菌群平衡;此外,低聚果糖在预防龋齿、促进矿物质吸收和排除肠内有毒废物等方面均发挥着重要功能^{[2, 3]}。因此,低聚果糖已作为一种营养强化剂广泛添加于各种食品特别是乳粉中^[4]。然而,低聚果糖来源多样且成分复杂,建立乳粉中低聚果糖的快速和准确检测方法仍然是一项极富挑战性的工作。

食品中添加的低聚果糖主要有两种来源,一种是以蔗糖为原料,由果糖基转移酶转化、精制而得到,其主要成分为蔗果三糖(1-kestose,GF₂)、蔗果四糖(nystose,GF₃)和蔗果五糖(fructofuranosyl-nystose,GF₄)^[5];另一种是以菊苣或菊芋提取的菊粉为原料,经酶解或酸解而生成的聚合度为2～9的果聚糖,其主要成分是果果三糖(inulo-triose,F₃)、果果四糖(inulo-tetraose,F₄)和果果五糖(inulo-pentaose,F₅)等。目前食品中低聚果糖的检测方法主要有高效液相色谱-蒸发光散射检测法^{[6, 7, 8, 9]}、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10, 11, 12]}、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法^{[11, 13]}等。其中,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对低聚果糖的定量能力较差;高效液相色谱-蒸发光散射检测法分离效果不够理想、灵敏度较低;离子交换色谱-脉冲安培检测法虽然灵敏度高、分离效果好,但该方法目前只能应用于一些较简单的基质,对于基质比较复杂的样品还存在着定量结果不准确、重现性差等不足^[14]。本研究针对复杂基质的乳粉样品,通过对样品前处理方法和色谱分离条件进行系统优化,建立了一种简便、快速、准确测定乳粉中低聚果糖含量的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)方法。本方法已成功应用于市售乳粉中低聚果糖含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ICS-3000离子色谱仪,包含四元梯度泵、ED3000电化学检测器、Au工作电极、pH-Ag/AgCl复合参比电极、钛对电极,Chromeleon 6.8色谱工作站和AS自动进样器(美国Dionex公司);XP 105分析天平(瑞士Mettler公司); Milli-Q Advantage A10超纯水机(美国Millipore公司); On Guard RP固相萃取柱(1 mL,美国Dionex公司); 0.22 μ m微孔尼龙膜(美国Pall公司)。

蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准品(日本Wako公司)。无水醋酸钠(美国Sigma公司); 50%氢氧化钠溶液(美国Fluka公司)。甲醇、乙醇、乙腈(色谱纯,美国Fisher公司)。亚铁氰化钾、乙酸锌(分析纯,上海国药集团)。实验用水均为电阻率不低于18.2 M Ω ·cm的超纯水。乳粉样品购自北京当地超市。

1.2 溶液的制备

1.2.1 标准溶液

蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准储备液(1 000 mg/L):准确称取10.0 mg(精确至0.1 mg)标准品,分别用超纯水溶解并定容至10 mL,4 ℃下贮存。蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准工作液:用水逐级稀释储备液,使其质量浓度为0.05～10 mg/L,4 ℃下贮存。

1.2.2 淋洗液

0.2 mol/L NaOH溶液:在2 L塑料试剂瓶中加入989.6 mL经过0.22 μ m尼龙滤膜过滤的超纯水,再移入50% NaOH溶液10.4 mL,通氮气保护后摇匀备用。

0.4 mol/L NaAc溶液:称取16.4 g无水乙酸钠固体,用水溶解并稀释至0.5 L,经0.22 μ m尼龙滤膜过滤后使用。

1.3 色谱条件

色谱柱:CarboPac PA200阴离子交换柱,包括分析柱(250 mm×3 mm)和保护柱(50 mm×3 mm);柱温:30 ℃;进样体积:25 μ L。以水(A)、0.2 mol/L NaOH溶液(B)和0.4 mol/L NaAc溶液(C)三元梯度淋洗;淋洗程序:0～5.0 min,40%B,0%C; 5.0～25.0 min,40%B,0%C～15%C; 25.0～30.0 min,40%B,15%C; 30.1～33.0 min,40%B,50%C; 33.1～35.0 min,100%B,0%C; 35.1～50.0 min,40%B,0%C。流速0.4 mL/min。

1.4 样品制备

准确称取0.500 g(精确至1 mg)乳粉样品于50 mL离心管中,首先加入10 mL 50%(v/v)乙醇水溶液,盖好盖后摇动使乳粉充分溶解;加入300 μ L 150 g/L 的亚铁氰化钾溶液后涡旋1 min,加入300 μ L 300 g/L 乙酸锌溶液后再涡旋1 min;最后加入5 mL乙腈,混匀后静置10 min,过滤至50 mL比色管中,滤渣用50%(v/v)乙醇水溶液冲洗数次,合并滤液并最终定容至50 mL。取其中1 mL于接收管中,用氮气吹干;用10 mL超纯水溶解,溶解液过On Guard RP柱(使用前用10 mL甲醇、10 mL水活化)以除去脂肪等疏水性化合物,弃去前3 mL滤液,收集中间2 mL滤液;过0.22 μ m水相滤膜,滤液待分析。如果低聚果糖浓度仍很高,可依据线性范围适当稀释。

图1 不同溶剂中相同浓度低聚果糖标准品的HPAEC谱图 Fig.1 HPAEC chromatograms of FOS standards with the same concentration in different solvents Solvents: a. 50%(v/v) ethanol aqueous solution; b. 25%(v/v) ethanol aqueous solution; c. 10%(v/v) ethanol aqueous solution; d. water.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

目前,对于食品中低聚果糖的检测,比较好的方法是离子色谱法。然而乳粉样品的基质复杂,仍缺乏有效的检测方法。美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)的方法^[15]是将乳粉样品用热水溶解后加入淀粉葡萄糖苷酶和菊粉酶酶解12 h,待样品中的低聚果糖和其他果糖聚合物分解成果糖和葡萄糖后,采用离子色谱法对果糖和葡萄糖进行定量并推算出低聚果糖含量。该方法不仅费时费力,而且无法区分低聚果糖和多聚果糖,定量不准确。张绩觅等^[16]向热水溶解的乳粉中加入磺基水杨酸沉淀蛋白质,然后将上清液过膜后通过离子色谱进行检测。我们采用该方法的分析结果表明,蔗果三糖、四糖、五糖的保留时间易发生漂移,方法准确度和耐用性差。Borromei等^[11]使用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀蛋白质、50%(v/v)乙醇水溶液萃取的方法对液态奶样品通过离子色谱法进行低聚果糖检测。我们采用该方法的分析结果表明,样品使用乙醇提取后进行离子色谱分析时,蔗果三糖受乙醇溶剂的干扰严重,基线上移,峰面积变小。图1显示了相同浓度的蔗果三糖、四糖、五糖标准品分别溶于去离子水及含10%、25%、50%乙醇的水溶液后的离子色谱图。可以看出,即使是使用含10%乙醇的水溶液溶解样品也会导致蔗果三糖的峰面积变小(减少约6% ),并且随乙醇含量的不断增加,蔗果三糖受到的抑制作用不断增强。推测原因可能是由于乙醇含有醇羟基且在色谱柱上无保留,蔗果三糖保留较弱,乙醇的醇羟基在检测器施加的脉冲电位信号下和蔗果三糖的羟基产生竞争作用。将提取溶剂用N₂吹干后用水复溶上样,溶剂对蔗果三糖的抑制作用消失。

乳粉样品不仅含有大量的蛋白质,还含有较多的脂类物质,因此对乳粉样品中糖类物质进行分析还需要除去脂肪的干扰。本研究对比了On Guard RP柱和Sep-Pak C₁₈两种小柱的除脂效果,结果表明,当GF₂、GF₃和GF₄完全从On Guard RP小柱洗脱出来时,部分GF₃和全部的GF₄依然保留在C₁₈小柱上,说明C₁₈小柱对低聚果糖的保留能力过强。因此最终选择使用On Guard RP小柱除脂。

2.2 色谱条件的优化

乳粉中同时含有单糖、双糖、低聚糖及多糖等多种碳水化合物,要实现如此复杂的糖类的同时分离难度较大。文献^[17]报道用于低聚糖分离的色谱柱主要有CarboPac PA1、CarboPac PA10、CarboPac PA100和CarboPac PA200等4种。考虑到乳粉基质复杂,且要分离的低聚果糖种类较多,需要使用粒径较小、柱效较高的色谱柱进行分离,本研究着重考察了CarboPac PA10(250 mm×4 mm)和CarboPac PA200(250 mm×3 mm)两种色谱柱对乳粉中低聚果糖的分离效果。结果表明,尽管CarboPac PA10和CarboPac PA200都可以对标准品进行良好的分离,但同样浓度的标准品在CarboPac PA200上的信号强度明显优于CarboPac PA10;且分析乳粉样品时,CarboPac PA10受到基质干扰较大,分离效果不佳(见图2a);而CarboPac PA200可以将低聚果糖与乳粉基质干扰物较好地分离。因此本研究最后选择使用CarboPac PA200色谱柱对乳制品中的低聚果糖进行检测。优化条件下分离低聚果糖标准品的色谱图见图2b。

图2 低聚果糖标准溶液及乳粉样品经(a)CarboPac PA10和(b)CarboPac PA200分离的HPAEC谱图 Fig.2 HPAEC chromatograms of FOS standards and milk powder sample on (a) a CarboPac PA10 column and (b) a CarboPac PA200 column Peaks: 1. GF₂; 2. GF₃; 3. GF₄.

食品中添加的低聚果糖有蔗糖来源和菊粉来源两种,本方法主要针对蔗糖来源的低聚果糖的检测。由于目前尚无F₃、F₄和F₅的标准品,所以无法对菊粉来源的低聚果糖进行精确定量,只能使用菊粉源的低聚果糖产品(酶解混合物)来考察本方法对F₃、F₄和F₅的定性和定量能力。图3显示了使用本文色谱条件时GF₂～GF₅、F₂～F₅的分离效果,其中对F₃、F₄和F₅的识别参考Borromei等^[10]的方法。从图3可以看出,包括F₂、GF₅在内的8种低聚果糖组分都得到了较好的分离。若以后能得到F₃、F₄和F₅标准品,本方法也可用于乳粉样品中菊粉来源的低聚果糖的精确定量。

表1 FOS的线性方程、相关系数、定量限、添加回收率及精密度(n=5) Table 1 Regression equations,correlation coefficients (r²),limits of quantification (LOQs), recoveries and relative standard deviations (RSDs) of FOS (n=5)

图3 添加GF₂、GF₃和GF₄标准品的菊粉来源低聚果糖样品的HPAEC谱图 Fig.3 HPAEC chromatogram of the FOS product from inulin spiked with GF₂,GF₃ and GF₄ standards Peaks: 1. GF₂; 2. F₂; 3. GF₃; 4. F₃; 5. GF₄; 6. F₄; 7. GF₅; 8. F₅.

2.3 方法的线性关系、定量限、回收率与精密度

在优化的实验条件下考察了GF₂、GF₃、GF₄在0.05～10 mg/L 范围内的线性关系和相关系数,分别以各化合物的质量浓度(mg/L)为横坐标x,峰面积为纵坐标y绘制标准曲线,得到线性回归方程。以GF₂、GF₃、GF₄标准溶液在信噪比(S/N)为10时的进样浓度定义为定量限。向生鲜乳样品中添加低、中、高3个水平的GF₂、GF₃、GF₄标准溶液,每个水平重复测定5次,计算方法的回收率和精密度,结果见表1。

2.4 方法应用

为了解市售乳粉中低聚果糖添加量的真实情况,本研究对购自市场的不同品牌的2种国产乳粉和7种进口乳粉样品进行了测定。从检测结果可知,2个国产乳粉中一个样品的标示值和检测值相符,另一个略低;7个进口乳粉样品的检测结果明显低于标示值,但这些样品有明显的F₃、F₄和F₅峰,推测这些乳粉样品中添加的是菊粉来源的低聚果糖。添加蔗糖来源和菊粉来源的乳粉样品的典型色谱图见图4,检测结果见表2。

图3 添加(a)蔗糖来源和(b)菊粉来源低聚果糖的乳粉样品的典型HPAEC谱图 Fig.3 Typical HPAEC chromatograms of milk powder samples added with FOS products from (a) sucrose and (b) inulin Peaks: 1. GF₂; 2. F₂; 3. GF₃; 4. F₃; 5. GF₄; 6. F₄; 7. GF₅; 8. F₅.

表2 9种乳粉样品中低聚果糖的检测结果(n=3) Table 2 Determination results of FOS in nine milk powder samples (n=3)

3 结论

本研究通过优化样品前处理条件和色谱分离条件,建立了乳粉中低聚果糖的高效离子交换色谱-脉冲安培检测方法。该方法样品前处理简单,精密度和灵敏度高。应用于实际乳粉样品的检测结果表明,该方法可以较好地识别出市售乳粉中的各组分低聚果糖,并能够对乳粉样品中添加的蔗糖来源的低聚果糖进行准确定量。

参考文献

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本文献在全文中的定位：

... 是果糖基经 β (2→1)糖苷键连接而成的聚合度(DP)为2～9的功能性低聚糖^[1] ...

本文献在全文中的定位：

... 低聚果糖在预防龋齿、促进矿物质吸收和排除肠内有毒废物等方面均发挥着重要功能^{[2, 3]} ...

本文献在全文中的定位：

... 低聚果糖在预防龋齿、促进矿物质吸收和排除肠内有毒废物等方面均发挥着重要功能^{[2, 3]} ...

本文献在全文中的定位：

... 低聚果糖已作为一种营养强化剂广泛添加于各种食品特别是乳粉中^[4] ...

本文献在全文中的定位：

... GF₄)^[5];另一种是以菊苣或菊芋提取的菊粉为原料 ...

本文献在全文中的定位：

... 目前食品中低聚果糖的检测方法主要有高效液相色谱-蒸发光散射检测法^{[6, 7, 8, 9]}、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10 ...}

本文献在全文中的定位：

... 目前食品中低聚果糖的检测方法主要有高效液相色谱-蒸发光散射检测法^{[6, 7, 8, 9]}、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10 ...}

本文献在全文中的定位：

... 目前食品中低聚果糖的检测方法主要有高效液相色谱-蒸发光散射检测法^{[6, 7, 8, 9]}、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10 ...}

本文献在全文中的定位：

... 目前食品中低聚果糖的检测方法主要有高效液相色谱-蒸发光散射检测法^{[6, 7, 8, 9]}、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10 ...}

本文献在全文中的定位：

... 9]、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10, 11, 12]}、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法^{[11 ...}

... 其中对F₃、F₄和F₅的识别参考Borromei等^[10]的方法 ...

本文献在全文中的定位：

... 9]、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10, 11, 12]}、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法^{[11 ...}

... Borromei等^[11]使用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀蛋白质、50%(v/v)乙醇水溶液萃取的方法对液态奶样品通过离子色谱法进行低聚果糖检测 ...

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... 9]、离子交换色谱-脉冲安培检测法^{[10, 11, 12]}、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法^{[11 ...}

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... 12]、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法^{[11, 13]}等 ...

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... 对于基质比较复杂的样品还存在着定量结果不准确、重现性差等不足^[14] ...

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... AOAC)的方法^[15]是将乳粉样品用热水溶解后加入淀粉葡萄糖苷酶和菊粉酶酶解12 h ...

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... 张绩觅等^[16]向热水溶解的乳粉中加入磺基水杨酸沉淀蛋白质 ...

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... 文献^[17]报道用于低聚糖分离的色谱柱主要有CarboPac PA1、CarboPac PA10、CarboPac PA100和CarboPac PA200等4种 ...