丙酸睾酮注射液,上海通用药业股份有限公司(L/N: 121203);非那雄胺(艾世列),杭州康恩贝制药有限公司(L/N: 20130201);乙腈和甲酸,色谱纯,美国Thermo Fisher Scientific公司;纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司;Acquity BEH C18分析柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m),Waters XEVO G2-S QTOF质谱仪,美国Waters公司;Centrifuge 5804R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;VORTEX QL-90涡旋混合器,江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。

4周龄雄性昆明种小鼠(20±2) g,自由饮水摄食,适应性喂养一周。随机分为3组,分别为空白对照组(control,n=8)、丙酸睾酮组(BPH model,n=7)和非那雄胺组(finasteride,n=8)。实验动物自由饮水。第1～4周丙酸睾酮组和非那雄胺组每日按5 mg/kg 剂量腹腔注射丙酸睾酮,空白对照组每日注射等体积生理盐水。第4～6周,非那雄胺组每日按0.8 mg/kg 剂量灌胃非那雄胺,其余两组每日灌胃等体积生理盐水。

第6周末,将小鼠用乙醚麻醉后摘除眼球取血,并于4 000 r/min 离心后取上清液;加入20倍体积乙腈去除蛋白质,涡旋混匀,于10 000 r/min 下离心10 min;取上清液,0.22 μ m微膜过滤,供UPLC-QTOF-MS测定。解剖分离前列腺组织,立即称重,计算前列腺指数(=前列腺平均重量/平均体重,mg/10 g)。

色谱条件:流动相A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B为0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液,采用梯度方式洗脱样品。梯度程序:0～3 min,5%B～70%B; 3～8 min,90%B; 8～9 min,100%B; 9～10 min,5%B～100%B; 10～12 min,5%B。柱温:35 ℃,流速:0.3 mL/min。自动进样器温度设定为15 ℃,进样量:2 μ L。

质谱条件:采用正离子模式;毛细管电压3.0 kV;锥孔电压40 V;脱溶剂气温度350 ℃;离子源温度120 ℃;锥孔气流量50 L/h;脱溶剂气流量600 L/h;采集时间范围0～12 min;扫描范围m/z 100～1 000;扫描时间0.1 s;扫描间隔0.02 s;使用甲酸钠对质谱仪器进行调谐,亮氨酸-脑啡肽实时精确校正质量。

采用Markerlynx软件(Waters,USA)进行色谱峰自动识别和峰匹配,每个样本的总峰面积归一化至 10 000。导出的峰表按照80%原则去除零值^[7]。将数据导入软件SIMCA-P+12 (Umetrics,Umea,瑞典)进行偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)。采用Mann-Whitney U检验分析生物标志物在各组间的差异。

图1为3组小鼠的前列腺指数,与空白对照组相比较,丙酸睾酮组前列腺指数显著增大(P＜0.01),表明模型建立成功;与模型组相比,非那雄胺组前列腺指数显著降低(P＜0.01),表明非那雄胺治疗前列腺肥大效果显著。

图1

Fig. 1

图1 3组小鼠的前列腺指数 Fig.1 Prostate indexes of three groups of mice * * P＜0.01,vs control group; ## P＜0.01,vs BPH model group.

采用UPLC-QTOF-MS进行血清样品的分离和数据采集,图2a、b和c分别为空白组、丙酸睾酮组和非那雄胺组小鼠血清样品的离子流基峰色谱图,可以观察到存在差异。

图2

Fig. 2

图2 (a)空白组、(b)BPH模型组和(c)非那雄胺组小鼠 血清样品的离子流基峰色谱图 Fig.2 Ion base peak intensity (BPI) chromatograms of serum samples of (a) control group,(b) BPH model group and (c) finasteride group mice

对数据进行了偏最小二乘-判别分析,图3a和b分别为空白组和模型组的得分图和载荷图。在得分图中,空白组和模型组获得了完全分离,其中95.8%的样本符合模型判别(R²Y=0.958),模型的预测能力为91.3%(Q²=0.913),表明模型可靠。图3c(截距R²=0.316,Q²=-0.301)也显示出模型没有过拟合。与空白组小鼠相比,丙酸睾酮组小鼠的血清代谢物谱发生了明显变化,丙酸睾酮可能影响正常小鼠血清中代谢物,导致小鼠体内代谢紊乱。载荷图中,每个三角表示1个化合物,离原点距离越远就表示这个化合物对空白组和模型组小鼠分类的贡献越大。结合变量权重重要性排序(VIP＞1)及相关系数(P_corr＞0.58)值共找出了对空白组和丙酸睾酮组分离贡献最大的8个变量,即潜在的生物标志物。

图3

Fig. 3

图3 空白组和BPH模型组的(a)得分图、(b)载荷图及 (c)20次置换检验的交叉验证结果 Fig.3 (a) Score plots and (b) loading plots of control group and BPH model group and (c) the cross-validation results with 20 times of permutation tests

图4a为空白组、丙酸睾酮组和非那雄胺组的得分图(R²Y=0.740,Q²=0.690),这3组能够完全分离,其血清代谢物谱有明显的区别,且非那雄胺组向空白对照组接近,说明药物具有一定的治疗效果,但未能使前列腺肥大模型小鼠完全恢复到健康的代谢水平。图4b(截距R²=0.031,Q²=-0.304)显示出模型没有过拟合。

图4

Fig. 4

图4 空白组、BPH模型组和非那雄胺组的(a)得分图和 (b)20次置换检验的交叉验证结果 Fig.4 (a) Score plots of control group,BPH model group and finasteride group and (b) the cross-validation results with 20 times of permutation tests

利用UPLC-QTOF-MS测得准确的相对分子质量,推测其可能的分子式。同位素匹配度越好,质量偏差越小的化合物为正确化合物的可能性越大^[8]。再根据相对分子质量和二级质谱数据结合METLIN、NIST、HMDB等数据库进行检索,对潜在的生物标志物进行分析,鉴定出1-十六烷酰基-SN-甘油基-3-磷酸胆碱(1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱,LysoPC(16 ∶ 0))、1-O-十六烷基-2-O-乙酰基-SN-甘油基-3-磷酸胆碱(血小板活化因子,PAF C-16)和(Z)-13-二十二烯酰胺(芥酸酰胺,erucamide)共3个生物标志物。图5反映了LysoPC(16 ∶ 0)、PAF C-16与erucamide在各组中的变化趋势:与空白组相比,丙酸睾酮组小鼠血清中前两种物质的含量均明显上升(P＜0.001),经非那雄胺干预均有显著的下降(P＜0.001);而芥酸酰胺在丙酸睾酮组小鼠血清中的含量明显下降,经非那雄胺干预后含量有显著的升高(P＜0.01),但是并未恢复到空白对照组的水平,且与空白对照组水平也有显著的差异(P＜0.01)。

图5

Fig. 5

图5 3个生物标志物在每组中的相对含量 Fig.5 Relative contents of the three potential biomarkers in each group * * * P＜0.001,* * P＜0.01,vs control group; ### P＜0.001,## P＜0.01,vs BPH model group.

在前列腺肥大模型小鼠血清中PAF C-16与LysoPC (16 ∶ 0)含量显著升高。两者均与磷脂合成途径有关,且两者在脂质代谢中起信号传导的作用。首先血小板活化因子(PAF)可以促进肿瘤坏死因子的产生;调节白介素、金属蛋白酶组织抑制因子-1、基质金属蛋白酶-1等的分泌加重炎症反应^[9]。其次PAF还可作用于花生四烯酸(AA),增加前列腺素(PGs)的释放,PGs的增加会加重前列腺肥大。Murphy等^[10]曾发现,利用非甾体类抗炎药抑制催化AA转化为PGs的重要限速酶环氧化酶干扰PGs的合成,可以缓解BPH合并前列腺炎患者的疼痛症状。并且PAF受体与G蛋白偶联后,磷酸酯酶C被激活,它作用于4,5-二磷酸磷脂酰肌醇,使其分解产生第二信使三磷酸肌醇和二酰基甘油,前者可诱导细胞Ca²⁺浓度的升高,后者可激活蛋白激酶C^[11]。这与 α 1肾上腺素受体介导的膀胱平滑肌收缩信号转导途径相同^[12]。平滑肌的收缩会导致BPH患者尿道压力的闭合性增强,引起尿流梗阻及膀胱刺激症状。近年来,对PAF在动物疾病模型及人的内脏中的作用研究较多,均发现其在疾病个体中水平升高,起到负调节的作用^{[13, 14, 15]}。

溶血磷脂酰胆碱(LPC)在前列腺癌和乳腺癌研究中均有报道^{[16, 17, 18, 19]}。在人体内,LPC会在溶血磷脂酶D的作用下转变成溶血磷脂酸(LPA)^[20],LPA是一种细胞膜脂类衍生物,它可以促进细胞增殖^[21]。有研究发现LPC可以通过巨噬细胞上的PAF受体转移Ca²⁺,影响Ca²⁺在胞浆中的水平^[22]。本实验观察到非那雄胺可以降低PAF C-16与LysoPC (16 ∶ 0)水平,提示其在体内调节BPH过程中涉及磷脂代谢。众所周知,非那雄胺是一种5 α -还原酶抑制剂,主要通过抑制前列腺内睾酮向双氢睾酮的转化来治疗BPH^[23]。但蓝儒竹等^[24]也曾发现非那雄胺可以通过调节血管内皮生长和凋亡因子来抑制BPH,说明其在人体内调节BPH的方式是多样的。芥酸酰胺是脂肪酸酰胺,通常以受体介导的方式调节各种生理功能。Hamberger等^[25]在对腹泻的研究中从血浆中也发现了芥酸酰胺,其有调节水分平衡的作用。但芥酸酰胺确切的生物学功能尚未确定,且报道较少,与前列腺肥大疾病的关系仍需进一步探究。

BPH的发病机制复杂,除了研究比较成熟的5 α -还原酶和 α 1肾上腺素受体外,磷酸二酯酶5、糖酵解酶、芳香化酶、生长因子、内皮素等也成为药物抗BPH的潜在靶点^{[26, 27, 28, 29]}。这些发现有助于设计并筛选出选择性更高、毒性更小的新型抗BPH药物,也是目前探索前列腺肥大治疗的一个重要方向。