色谱  2014, Vol. 32 Issue (12): 1362-1367   PDF (875 KB)    
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吴翠琴
雷金妹
李韵灵
王韵靓
陈迪云
龚剑
基于离子液体的分散液液微萃取-柱前荧光衍生高效液相色谱法测定水样中8种磺胺类药物
吴翠琴1,2,3 , 雷金妹1, 李韵灵1, 王韵靓1, 陈迪云1,2,3, 龚剑1,2,3    
1. 广州大学环境科学与工程学院, 广东 广州 510006;
2. 广东省放射性核素污染控制与资源化重点实验室, 广东 广州 510006;
3. 珠江三角洲水质安全与保护省部共建重点实验室, 广东 广州 510006
收稿日期：2014-8-11
基金项目：国家自然科学基金项目(21207022,41372364);广东省大学生创新训练项目(1107813009).
通讯作者：吴翠琴,E-mail:wucuiqin@gzhu.edu.cn.
摘要：建立了一种基于离子液体的分散液液微萃取技术结合柱前荧光衍生高效液相色谱(IL-DLLME-HPLC-FL)对8种磺胺类药物进行检测的方法,并成功应用于实际环境水样的分析。实验考察了萃取参数对磺胺萃取效率的影响及衍生产物的稳定性。最佳实验条件:以40 μL [C6MIM]PF6]为萃取剂,0.1 mL丙酮为分散剂,对pH=4且不含NaCl的水溶液进行不超声的分散液液微萃取,并衍生化反应6 h。结果表明:在最佳实验条件下,该法在0.2~10 μg/L和10~500 μg/L两个浓度范围内线性良好,线性相关系数r ≥0.9989;检出限为0.08~0.5 μg/L (S/N=3)。对实验室自来水、湖水、珠江水、池塘水分别加标5、50、200 μg/L的回收率为87.2%~101.4%,相对标准偏差为3.7%~6.2%。该法环保、简便,可用于测定实际水样中磺胺类药物。
关键词： 离子液体     分散液液微萃取     高效液相色谱     荧光检测     磺胺类药物    
Combination of dispersive liquid-liquid microextraction based on ionic liquid and pre-column fluorescence derivatization-high performance liquid chromatography for determination of eight sulfonamides in water samples
WU Cuiqin1,2,3 , LEI Jinmei1, LI Yunling1, WANG Yunliang1, CHEN Diyun1,2,3, GONG Jian1,2,3    
1. College of Environmental Science and Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China;
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Radionuclides Pollution Control and Resources, Guangzhou 510006, China;
3. Key Laboratory for Water Quality Security and Protection in Pearl River Delta of Ministry of Education and Guangdong Province, Guangzhou 510006, China
Received: 2014-8-11
Abstract: Dispersive liquid-liquid microextraction based on ionic liquid coupled with high performance liquid chromatography (HPLC) and pre-column fluorescent derivatization method (IL-DLLME-HPLC-FL) was developed for the determination of eight sulfonamides (SAs). The influence of IL-DLLME parameters on extraction efficiency and the stability of derivatives of the eight SAs were investigated. The optimized experimental conditions were as follows: 40 μL [C6MIM]PF6] as extraction solvent, 0.1 mL acetone as dispersion solvents; water sample with 0% NaCl (pH 4) was extracted by dispersive liquid-liquid microextraction without ultrasonic-assistance and then derivatized for 6 h. Under the optimized experimental conditions, the results indicated that the eight sulfanilamides showed good linearities when their mass concentrations were in 0.2-10 μg/L and 10-500 μg/L, and the linear correlation coefficients were no less than 0.9989. The detection limits ranged from 0.08 μg/L to 0.5 μg/L (S/N=3). The proposed method was applied to the analysis of four water samples from different sources (tap water, lake water, Pearl River water and pond water). The relative recoveries of the SAs spiked in water samples were 87.2%-101.4% with the relative standard deviations of 3.7%-6.2% at three different concentration levels of 5, 50 and 200 μg/L. It is a convenient, environmental friendly method for the routine analysis of SAs in water samples.
Key words: ionic liquid (IL)     dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME)     high performance liquid chromatography (HPLC)     fluorescence detection     sulfonamides (SAs)    

磺胺类药物(sulfonamides,SAs)因其抗菌谱广,高效,价格低廉,且可促进动物生长被广泛应用于畜牧和水产养殖业,是目前最广泛使用的抗生素之一[1, 2]。这些药物可随尿液、粪便、养殖废水等排放到环境水体中,对环境质量和生态系统安全造成隐患[3, 4, 5]。因此对环境水样中磺胺类药物的检测越来越受到人们的重视。

目前此类药物的测定主要是通过色谱和质谱联用技术进行[6, 7, 8]。色谱后接质谱或串联质谱可提高定量分析的选择性和灵敏度,但也势必大大增加分析检测的原始成本和运行费用。高效液相色谱法(HPLC)与其他液相色谱-质谱、气相色谱-质谱联用或后接串联质谱的方法相比较而言价格低得多。

环境水体中SAs含量极低,且基质复杂,因此在进行色谱检测前需要对其进行分离富集。目前对环境水体中SAs的前处理方法有多种,如液液萃取[9]、固相萃取[10, 11]、微波萃取[12]、固相微萃取[13]等,但这些方法有较多不足,如操作复杂、前处理时间长、使用大量有毒有机溶剂等。液液微萃取集富集、分离、净化为一体,具有操作简单、耗时短等特点,已被用于磺胺类药物的测定。如本课题组[14]用单滴液液微萃取高效液相色谱法测定了水体中7种磺胺类药物,达到了比较理想的效果,但是单滴液液微萃取萃取时间较长,而且液滴不好控制。分散液液微萃取(DLLME)是2006年由Rezaee等[15]率先提出的一种液相微萃取富集技术。该方法具有操作简单、快速、经济、萃取效果好和环境友好等优点,因此得到较好的应用,如常安刚等[16]采用温度驱动的离子液体DLLME法同时检测了环境水体中2种磺胺类药物。Xu等[17]采用基于离子液体的微波辅助DLLME分离富集水样、蜂蜜、牛奶等基质中的6种磺胺类物质。

本文以8种典型的SAs(磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺醋酰(SAAM)、磺胺甲噻二唑(STZ)、磺胺-5-甲氧嘧啶(SM)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺多辛(SDX)、磺胺二甲异二唑(SLX)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM) )为研究对象,采用基于离子液体的DLLME的分离富集技术对样品进行富集浓缩前处理;随后采用柱前荧光胺衍生,HPLC-荧光检测器进行分离测定。建立了一种简便、环保、实用的测定实际水体中SAs的分析方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),配备荧光检测器;TDL-4台式离心机(上海安亭科学仪器厂);超声波清洗仪(美国cole-parmer公司);电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司); PB-10标准型pH计(德国Sartorius); SK-1快速混匀器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司); AL-01型溶剂过滤器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司,AP-01P泵+1 000 mL过滤瓶); 25 μ L微量进样器(美国Hamilton公司)。

SDZ、SAAM、STZ、SM、SCP、SDX、SLX、SDM标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司,纯度均≥98.0% 。荧光胺购自美国Sigma公司,纯度≥99.0% 。1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C4MIM][PF6])、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C6MIM][PF6])、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8MIM][PF6])纯度均为99% ,购自上海成捷化学有限公司;乙腈为色谱纯,购自上海安谱科学仪器有限公司。其他试剂均为分析纯;实验用水为超纯水。

1.2 溶液的配制与实际水样

精密称取SDZ、SAAM、STZ、SM、SCP、SDX、SLX、SDM标准品各 0.005 0 g于8个5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成1 g/L 的8种SAs的单标准储备液。准确移取8种SAs单标准储备液各0.5 mL置于同一5 mL容量瓶中,用甲醇定容,配成100 mg/L SAs的混合标准储备液。单标准和混合标准储备液置于冰箱中-18 ℃下避光保存。实验时不同浓度的工作曲线由标准储备液稀释而得。

0.2 g/L 荧光胺丙酮溶液:准确称取10.0 mg荧光胺,用丙酮溶解并定容至50 mL。

实验水样分别为实验室自来水、校园里的湖水、珠江水和池塘水。使用前经过0.45 μ m滤膜过滤,然后一天之内进行富集浓缩前处理。

1.3 色谱条件

色谱柱:Agilent Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:乙腈和0.5%乙酸水溶液(40:60,v/v);流速:1.0 mL/min;检测波长: λ ex=405 nm,λ em=495 nm;进样量:20 μ L;柱温:20 ℃。

图1 (a)萃取剂种类、(b)萃取剂体积、(c)分散剂种类和(d)分散剂体积对SAs萃取效率的影响 Fig.1 Effects of (a) the type of extraction solvent,(b) extraction solvent volume,(c) the type of dispersion solvent and (d) dispersion solvent volume on extraction efficiencies of the SAs Experimental conditions: sample volume,2.0 mL; sample pH value,4; ionic strength,0 g/L NaCl; ultrasonic time,0 min; derivatization time,30 min. (a) volume of extraction solvent,40 μ L; dispersion solvent,0.1 mL acetone. (b) extraction solvent,[C6MIM][PF6]; dispersion solvent,0.1 mL acetone. (c) extraction solvent,40 μ L [C6MIM][PF6]; volume of dispersion solvent,0.1 mL. (d) extraction solvent,40 μ L [C6MIM][PF6]; dispersion solvent,acetone.
1.4 样品预处理

准确移取2.0 mL已用0.1 mol/L HCl调至pH=4的水样于10 mL离心管中。将40 μ L [C6MIM][PF6](萃取剂)与0.1 mL的丙酮(分散剂)混合,然后迅速注入上述水样中,混匀,以 4 000 r/min 离心10 min。离心后的下层离子液体相转移至棕色样品瓶中,加40 μ L丙酮溶解,再加115 μ L 0.6 mol/L 乙酸钠缓冲溶液(用1 mol/L HCl调节至pH=3)和60 μ L 0.2 g/L 荧光胺丙酮溶液,充分混匀,置于黑暗处衍生化反应6 h(优化DLLME的萃取条件时,衍生化时间为30 min),衍生后的样品溶液取20 μ L进行高效液相色谱-荧光检测分析。

2 结果与讨论
2.1 样品前处理条件的优化
2.1.1 萃取剂种类和体积的选择

对萃取剂的选择应满足:不溶于水,对待测物有强的溶解能力,对样品的测定干扰小。选择3种不同烷基链的咪唑型离子液体作为萃取剂进行实验,结果见图1a。从图1a中可知,[C4MIM][PF6]和[C6MIM][PF6]对8种SAs的萃取效率明显高于[C8MIM][PF6]。但考虑到[C4MIM][PF6]比[C6MIM][PF6]更易溶于水,不利于离心后沉淀相的提取,对实验的重现性有一定的影响,因此选择[C6MIM][PF6]作为样品前处理的萃取剂。

在固定分散剂丙酮的加入量为0.1 mL的情况下,考察了不同[C6MIM][PF6]用量对萃取效率的影响,如图1b所示。当[C6MIM][PF6]的体积为40 μ L时,对8种SAs的萃取效果均最佳,这是因为萃取剂体积小时,萃取不充分,而随着萃取剂体积增大,会使沉积相的体积增大,从而稀释待测物的浓度,因此,选择萃取剂的用量为40 μ L。

2.1.2 分散剂种类和体积的选择

分散剂是影响萃取效率的又一重要因素,所选的分散剂应该与萃取剂和水有良好的混溶性。选择4种常用的分散剂(乙醇、甲醇、丙酮、乙腈)来考察对SAs萃取效率的影响,如图1c所示。相对于其他3种分散剂,丙酮作为分散剂对磺胺的萃取效果最好。

在固定40 μ L [C6MIM][PF6]作为萃取剂,考察了0.1、0.2、0.3、0.4 mL丙酮对萃取效率的影响(见图1d)。随着丙酮加入量的增大,萃取效率降低。这是由于增加分散剂的体积会导致离子液体在水样中的溶解度增大,从而使SAs在水样中的溶解度也增大。因此,选择分散剂丙酮的用量为0.1 mL。

2.1.3 水样pH值的影响

对于极性化合物的萃取,样品溶液的pH值可以改变目标物的存在形式,从而影响萃取效率。实验中考察了水样不同pH值对萃取效率的影响(见图2a)。当pH=4时,萃取剂对磺胺类抗生素的萃取效率最高。这可能是由于pH=4时,磺胺类药物主要是以中性分子的形式存在,更容易被萃取到[C6MIM][PF6]中。因此,萃取前先把水样的pH值调至4。

图2 (a)水样pH值和(b)离子强度对SAs萃取效率的影响 Fig.2 Effects of (a) sample pH value and (b) ionic strength on extraction efficiencies of the SAs Extraction conditions: sample volume,2.0 mL; extraction solvent,40 μ L [C6MIM][PF6]; dispersion solvent,0.1 mL acetone; ultrasonic time,0 min; derivatization time,30 min. (a) ionic strength,0 g/L NaCl. (b) sample pH value,4.
2.1.4 离子强度的影响

为了考察离子强度对萃取效率的影响,在其他实验条件不变的情况下,分别加入不同质量浓度(0、100、200、300 g/L)的NaCl进行实验,得到不同的萃取效果,如图2b所示。随着NaCl浓度的增加,萃取效率下降,特别是当NaCl的浓度达到300 g/L,下降得很明显,这可能是因为[C6MIM][PF6]与NaCl发生了离子交换,生成[C6MIM]Cl溶于水,导致[C6MIM][PF6]减少,萃取效率降低[17]。因此,本实验中不加NaCl。

2.1.5 超声辅助萃取的影响

超声辅助分散液液微萃取由于能够加速不互溶两相间的质量传递,缩短萃取时间,节约溶剂,提高萃取效率而被广泛应用。实验中尝试采用超声的方法进行萃取,设置萃取时间为0、5、10 min。结果表明,萃取效率随超声萃取时间的延长无明显变化,体系中加入分散剂和萃取剂,混匀,离心即可。萃取时间非常短,这是DLLME的主要优势之一。因此,本实验中不采用超声辅助萃取。

2.1.6 衍生时间的影响

由于SAs具有氨基,因此可以采用荧光胺试剂进行柱前或柱后衍生,生成强荧光物质,利用荧光检测器检测来提高灵敏度。在DLLME萃取后的含有目标化合物的离子液体相中加入衍生化试剂荧光胺后,置于室温(20 ℃)避光密闭衍生,分别在不同时间取样用HPLC测定其峰面积,结果见图3。可以看出,8种SAs的衍生化产物的峰面积在0～6 h均随衍生化时间的增大而增大,6 h后基本达到稳定,STZ和SDM衍生20 h后有所下降。因此,样品衍生化反应后应在6～20 h内测定。为了节约时间,衍生化6 h后进行测定。

图3 衍生时间对8种磺胺类药物测定的影响 Fig.3 Effects of derivatization time on determination of the eight SAs Extraction conditions: sample volume,2.0 mL; extraction solvent,40 μ L [C6MIM][PF6]; dispersion solvent,0.1 mL acetone; sample pH value,4; ionic strength,0 g/L NaCl; ultrasonic time,0 min.
2.2 方法的线性范围和检出限

在优化的实验条件下,分析了不同质量浓度(0.2～500 μ g/L)的超纯水加标溶液,考察了各组分的线性范围、检出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)及加标水平为5 μ g/L 样品的5次平行测定的RSD,如表1所示。为了减少误差,把浓度划分2个范围分别做工作曲线。

表1 8种磺胺类药物的线性范围、回归方程、检出限、定量限及精密度(RSD) Table 1 Linear ranges,regression equations,LODs,LOQs and RSDs of the eight SAs

与其他方法比较的结果见表2。文献[16]报道的方法只测定了2种磺胺类物质,其中SDM的检出限为1.22 μ g/L,本方法的检测灵敏度至少高1个数量级,而且本方法是同时测定8种磺胺类药物。另外,文献[17]也采用了荧光胺衍生,SDM的检出限为0.012 μ g/L,灵敏度比本方法高1个数量级,但其采用了微波辅助萃取。虽说本方法的灵敏度不及固相萃取柱分离富集及液相色谱-质谱检测的灵敏度[18],但是本方法有它们无法比拟的优点,如简单，萃取时间短，所需的样品量少，溶剂少等。

表2 本方法与其他方法的比较 Table 2 Comparison of this method with other methods
2.3 实际水样的测定及加标回收率

在优化的实验条件下,对实际水样如实验室自来水、湖水、珠江水以及池塘水分别进行3次的平行分析测定,检测出珠江水和池塘水中含有磺胺甲噻二唑,其平均含量分别为0.29 μ g/L 和0.26 μ g/L,检测的量级跟文献[5]报道一致。对实际水样分别加标5、50、200 μ g/L,平行测定5次,所获得的加标回收率和RSD如表3所示。从表3中可知,加标回收率在87.2%至101.4%之间,RSD在3.7%至6.2%之间,结果满意。经IL-DLLME萃取荧光胺柱前衍生后HPLC-FL测定的标准溶液谱图和部分实际样品的色谱图见图4。

图4 (a)超纯水、(b)珠江水和(c)超纯水加标(8种磺胺各5 μ g/L)的色谱图 Fig.4 Chromatograms of (a) ultrapure water,(b) Pearl River water sample and (c) ultrapure water spiked with the eight SAs (5 μ g/L)

表3 8种磺胺类药物在实际水样中的加标回收率及精密度(n=5) Table 3 Recoveries and their precisions (RSDs) of the the eight SAs spiked in real water samples (n=5)
3 结论

本文所建立的基于离子液体的分散液液微萃取技术结合柱前荧光衍生高效液相色谱法(IL-DLLME-HPLC-FL)可以测定实际水样中的SAs,有一定的实用参考价值,该法具有操作简便、萃取速度快、重现性好、样品和试剂用量少、环境友好等优点。

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