亲水作用色谱/质谱联用方法用于大肠杆菌代谢组分析


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	王希越

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王希越, 高鹏 , 许国旺

中国科学院分离分析化学重点实验室, 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁大连 116023

收稿日期：2014-8-11

通讯作者：Tel: (0411) 84379532, 高鹏，E-mail：gaop@dicp.ac.cn

摘要：建立了两性离子亲水作用色谱/质谱联用方法用于大肠杆菌胞内极性代谢物的分离分析。选取52个代表性极性物质对方法进行考察，发现此方法有较好的线性范围，且大部分物质最低检测限均在ng/mL数量级。平行制备6份样品进行分析，结果显示85%以上代谢物峰面积的RSD值小于30%。6个内标物质在低、中、高3个浓度下的日内精密度（RSD）均小于20%，大部分物质的相对回收率都在可接受的范围内（70%~130%）。把此方法用于yfcC基因改造的3株大肠杆菌代谢组分析，发现一些小肽、氨基酸、核苷、有机酸、磷脂等物质在基因改造后发生明显变化。此研究结果表明，建立的两性离子亲水作用色谱/质谱方法检测到的物质化学性质分布广，跨越了极性磷脂到小肽的各个范围，且具有良好的重复性、稳定性和适用性。

关键词：两性亲水作用色谱/质谱极性物质大肠杆菌代谢组分析

Hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with mass spectrometry for metabolomic analysis of Escherichia coli

WANG Xiyue, GAO Peng , XU Guowang

Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China

Received: 2014-8-11

Abstract: The zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with mass spectrometry (ZIC-HILIC/MS) method was developed and applied for studying the metabolome of Escherichia coli. In this method, the linear ranges of the 52 representative compounds were between 2-6 orders of magnitude. Moreover the lowest limits of detection of most compounds were at ng/mL levels. The analysis for six samples prepared in parallel showed that the method had good reproducibility with more than 85% metabolites with the RSDs of peak area less than 30%. The precision of the method was tested by evaluating the relative recoveries of six internal standards at the low, middle and high concentrations. The results exhibited that the intraday precisions (RSDs) of the six compounds in the same concentrations were less than 20%. The recoveries of most compounds were accepted in the range of 70%-130%. The results of metabolomic analysis of three Escherichia coli strains with genetic modified yfcC gene showed that some small peptides, amino acids, nucleosides, organic acids and phospholipids changed differentially after the yfcC gene modification. These results indicated that the ZIC-HILIC/MS method could detect diverse metabolites and be used for metabolomic analysis purpose with good reproducibility and stability.

Key words: zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography/mass spectrometry (ZIC-HILIC/MS) polar metabolites Escherichia coli metabolomic analysis

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后系统生物学的又一重要组成之一,主要研究遗传或环境扰动后生物体内小分子代谢物的变化情况^[1]。代谢物作为细胞代谢活动的最终执行者,其变化情况更能体现生物的表型变化,因此通过代谢组学研究可以更进一步揭示细胞的生理和功能状态^[2]。随着代谢组学分析技术的飞速进步,其在疾病标志物发现^{[3, 4, 5, 6]}、植物生理^[7]、毒理学^{[8, 9]}、医药研究^[10]、微生物^{[11, 12]}等领域的应用也越来越广。微生物是地球上分布最广的物种之一,一些有益的微生物可以用来发酵生产食品、化工原料和生物燃料,还可用于清理环境中的污染物,维持生态平衡等^[13]。近年来人们致力于结合代谢组学和已有的基因组结果进行功能基因组学研究,以期了解更多未知基因的功能,深入研究微生物体内代谢途径和网络调控的关系,掌握其生理状态,通过定向基因改造使其能更好地被我们利用。

大肠杆菌生长迅速,营养需求简单,是一种重要的工业微生物之一。基因重组后的大肠杆菌能高效地生产一些化工用品如醇、氨基酸、有机酸、抗生素等^{[14, 15, 16, 17]}。大肠杆菌体内主要的代谢物大部分是极性物质,包括氨基酸、有机酸、磷酸糖、核苷、辅酶以及核苷酸等^[18],它们参与中心碳代谢中的糖酵解、磷酸戊糖途径、氨基酸代谢和三羧酸循环等关键代谢途径。针对这些极性物质的分析,常用的方法包括气相色谱/质谱(GC/MS)联用技术、毛细管电泳/质谱联用技术(CE/MS)和亲水作用色谱/质谱联用技术(HILIC/MS)等^[19]。GC/MS具有灵敏度高,分离度、稳定性好等优势,常用于细菌胞内代谢物分析,但是其仅适用于挥发性和热稳定性好的物质,对一些低挥发性或不挥发的物质需要衍生化来增加其挥发性,实验过程繁琐,耗时费力^[20]。CE/MS对各种极性的离子型化合物有很好的分离效率,而且其所需样品量少,流动相成本低,但是其灵敏度和保留时间重复性差,因此限制其广泛应用。而HILIC/MS能为极性物质提供合适的保留,流动相与质谱兼容性好,可提高物质的离子化效率,灵敏度高,比较适合极性物质的分离分析^[21]。2006年,Bajad等^[22]发展了一种基于氨基柱的HILIC-MS/MS方法,可有效地分离检测出141个亲水性物质,并成功地实现了69个大肠杆菌胞内提取物的定量分析。2010年,Preinerstorfer等^[23]利用选择反应监测(SRM)模式发展了一种基于两性离子固定相的HILIC-MS/MS方法,检测出200多个极性物质,从抗生素发酵液提取物中检测出约90个物质。2012年,Yuan等^[24]发展的HILIC-MS/MS方法实现了258个极性代谢物的检测。利用SRM模式发展的HILIC-MS方法灵敏度高,可实现物质的定量分析,但这种方法仅适用于有标准品的物质检测,在实际应用中容易漏掉一些未知物质的信息。

本文发展了一种基于两性离子的亲水作用色谱与质谱联用的代谢轮廓分析方法用于大肠杆菌胞内极性物质的分离分析。该方法所检测物质的化学性质覆盖范围宽,可以实现包括极性磷脂、小肽等物质的检测分析,而且具有良好的线性范围、准确性和重复性。yfcC是大肠杆菌内功能未知的基因,作者前期工作发现yfcC基因过表达可能激活乙醛酸途径^[25]。为进一步研究其扰动的代谢变化,把本实验中建立的方法用于yfcC基因改造的3株不同遗传背景的大肠杆菌代谢组分析,发现基因改造后,一些小肽物质发生了显著的变化,大部分小肽在yfcC基因过表达(Y+)菌内显著上调,而在yfcC基因敲除(Y-)菌内显著下调,另外一些核苷、氨基酸、有机酸、磷脂等物质也发生了显著变化。本实验结果说明此方法有较好的稳定性与适用性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity高效液相色谱仪(美国Waters公司),Thermo Scientific LTQ-Orbitrap-XL质谱仪(美国),Cenco涡旋仪,高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司),Labconco真空离心浓缩仪(美国Labconco公司),混合研磨仪MM400 (德国Retsch公司),UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司),ZHWY-211C恒温摇床培养箱、ZHJH-1112超净工作台(上海智城分析仪器公司)。氯仿、甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司),乙酸铵、乙酸(色谱纯,美国Fluka公司),实验用水为Milli-Q系统(美国Millipore公司)制备的高纯水。实验中所用标准品购自美国Sigma-Aldrich公司、中国Alfa aesar或百灵威公司。

1.2 实验方法

1.2.1菌株及培养条件

大肠杆菌MG1655购自上海北诺生物科技公司,带有质粒pBCTE大肠杆菌AS1.1566 (W)及其yfcC基因过表达菌株(Y+)和敲除菌株(Y-)由中国科学院大连化学物理研究所生物技术部1816组提供。细菌用LB培养基在37 ℃恒温摇床培养箱内,于160 r/min 条件下培养,除MG1655外,其他3株菌培养时在培养基内添加30μ g/mL 氯霉素。单菌落先在20 mL培养基内过夜培养活化,然后转接到新的50 mL培养基内继续培养6 h,所得菌体用于后续的样品处理分析。

1.2.2样品预处理

样品处理根据作者前期发表的文章^[25]方法进行,但稍有一些改动。将50 mL菌液迅速倒入装有40 mL -80 ℃生理盐水的塑料瓶中,手动把冰块弄碎，然后上下晃动瓶子使菌液温度快速降低,倒出20 mL菌液于50 mL离心管中,在8000 r/min 、4 ℃条件下离心3 min,所得菌体依次用30 mL和1.5 mL磷酸盐缓冲液(0 ℃)清洗,转移到2 mL离心管中,再用13 mmol/L 的乙酸铵1 mL淋洗一次。加入1 mL氯仿(-20 ℃),用混合研磨仪在20次/s的频率下研磨30 s,加入含6个内标(Phe-d₅ 0.04μ g/mL,Met-d₃ 0.04μ g/mL,Gln-d₄ 0.20μ g/mL,Leu-d₃ 0.04μ g/mL,succinic-d₄ 0.40μ g/mL,L-methionine sulfone 0.60μ g/mL)的0.5 mL甲醇/水(21/79,v/v,-4 ℃)提取液,涡旋60 s,在10000 r/min、4 ℃条件下离心6 min,取出上清液400μ L,剩下的样品再用0.5 mL甲醇/水提取一次,取上清液500μ L与第一次的上清液混合,在 14000 r/min 下离心15 min,各取出400μ L冻干,分别用于正离子和负离子模式分析。于-80 ℃下保存待用。方法验证中的QC样品由淬灭后的所有菌液混合组成,后续处理方法同上所述。

1.2.3样品分析

色谱条件:色谱柱为SeQuant ZIC-HILIC (150 mm×2.1 mm,3.5μ m,德国Merck公司)。流动相A为10 mmol/L 乙酸铵+0.02%乙酸水溶液; 流动相B为水-乙腈(10 ∶ 90(v/v)，含10 mmol/L 乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸)。流动相洗脱梯度:0 min,100%B; 2 min,95%B; 18 min,70%B; 27 min,45%B;平衡4 min后,于0.1 min内升至100%B,平衡10 min。流动相流速0.2 mL/min,色谱柱温度35 ℃,自动进样器温度4 ℃,冻干样品用100μ L 80%(v/v)甲醇水溶液复溶,进样3μ L。

质谱条件:电喷雾离子源,分别在正、负离子模式下扫描,质谱扫描范围m/z 70～1000。正离子模式下鞘气流速35 arb,喷针电压4.5 kV,毛细管电压49 V,毛细管温度350 ℃;负离子模式下鞘气流速35 arb,喷针电压-4.0 kV,毛细管电压-37 V,毛细管温度325 ℃。

1.2.4数据处理

正、负离子模式采集到的原始数据分别经Xcalibur软件Fileconverter功能转化成cdf格式,再用XCMS程序进行峰过滤,保留时间对齐及峰匹配^[26]。XCMS程序参数设置为:fwhm=30,max=100,snthresh=10,minfrac=0.25,step为m/z 0.1。得到的代谢物特征用总峰面积归一及80%规则处理,然后导入软件SIMCA-P 11.0 (Sweden)进行偏最小二乘-判别分析(PLS-DA),模型中变量重要性(the variable importance in the project,VIP)大于1且经非参数检验后p值小于0.05的变量被认为是潜在的差异物质,这些差异物质经精确质量数、二级质谱信息及Metlin、HMDB等数据库信息进行结构鉴定。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

以氨基酸、有机酸、磷酸糖、核苷类、核苷酸类共50个常见极性标准物质作为检测样品,考察了4根亲水色谱柱Waters BEH HILIC (100 mm×2.1 mm,1.7μ m),Waters BEH Amide (100 mm×2.1 mm,1.7μ m),TSKgel Amide 80 (150 mm×2.0 mm,3.0μ m),SeQuant ZIC-HILIC (150 mm×2.1 mm,3.5μ m),以寻找一种较好的色谱柱分析系统。综合考虑各类物质在每根柱上的峰形和分离度,发现4根柱对大部分氨基酸、有机酸和核苷都具有较好的分离选择性,且都能得到较对称的色谱峰,但磷酸糖类和核苷酸类物质在ZIC-HILIC柱上有相对较好的分离度和峰形,所以我们选择ZIC-HILIC柱作为分析柱并进行色谱条件的优化。

2.2 色谱条件的考察

2.2.1盐浓度的优化

增大缓冲盐浓度可改善峰形,并提高物质的分离度,但过大的盐浓度会影响待测物在质谱上的离子化效率,降低检测灵敏度,同时容易污染离子源,造成检测结果重复性差。流动相A为5、10、15、20 mmol/L 乙酸铵溶液，流动相B为水-乙腈(10 ∶ 90(v/v)，含5、10、15、20 mmol/L 乙酸铵)，将准备好的标准品和样品在每个条件下各分析3次,结果见图1。实验表明,随着流动相中盐浓度的增加,总峰面积降低,但总分离度是升高的。代谢轮廓分析期望通过色谱分离能得到尽可能多的代谢物信息,同时希望检测到的化合物有较高的质谱响应。所以综合考虑,流动相中盐浓度选择10 mmol/L 乙酸铵。

图1 乙酸铵浓度的优化 Fig.1 Optimization of ammonium acetate concentration a. sample under ESI⁺; b. sample under ESI^-; c. mixture of 25 standards under ESI⁺; d. mixture of 25 standards under ESI^-.

2.2.2pH值的优化

在含10 mmol/L 乙酸铵的流动相A、B中分别加入0、0.02% 、0.06% 、0.12%(v/v)乙酸,使流动相的pH值分别为6.8、5.0、4.5、4.0,将准备好的标准品和样品,在每个条件下分析3次,结果如图2。可以看出,在正离子模式下pH=4时代谢组的总响应最大,而在负离子模式下代谢组的总峰面积在pH=6.8时最大。随着pH的增加,所检测标准品的总分离度增加。带磷酸的物质如核苷酸在pH较大时,峰形对称性好些。综上所述,结合每个pH值下代谢组的总峰面积、峰个数、分离度及标准物峰形,最终认为pH=5条件下得到的结果较好,所以选择流动相的pH=5。

图2 流动相pH值的优化 Fig.2 Optimization of pH of mobile phase a. sample under ESI⁺; b. sample under ESI^-; c. mixture of 23 standards under ESI⁺; d. mixture of 23 standards under ESI^-.

2.2.3复溶溶剂的考察

对于亲水色谱分析方法,一般要求进样溶剂至少有50%的有机溶剂,以获得满意的色谱峰形,但是高比例的有机溶剂可能会降低极性物质的溶解度,因此我们对样品的复溶溶剂进行了考察。冻干样品分别用100%甲醇、80%甲醇、60%甲醇和80%乙腈复溶后进样分析,结果显示,随复溶溶剂极性的增加,检测到的代谢物的数量和总峰面积也增加,但是考虑到色谱峰形以及色谱柱的使用寿命,最终选择80%甲醇作为样品复溶溶剂。

2.3 方法考察

2.3.1线性范围与检出限

配制包含氨基酸、有机酸、核苷、磷酸糖、核苷酸和辅酶等共52个代表性极性物质的一系列标准溶液,按优化的色谱方法进行分析,每个物质的峰强度选择一个内标进行校正,再与相应的浓度进行线性拟合。结果显示各物质的线性范围都较好,在2～6个数量级之间,且线性相关系数(r)均在0.99以上,详细结果见表1。

表1 52个代表性极性物质的线性回归方程、相关系数、线性范围和最低检测限 Table 1 Linear regression equations,correlation coefficients (r),linear ranges and the lowest limits of detection (LLOD) of 52 representative compounds

Compound	Regression equation	r	Linear range/(μg/mL)	LLOD/(ng/mL)	Detection mode	Internal standard
L-Valine	y=1.3898x+0.5456	0.9929	0.0100-25.0	＜0.2	[M+H]⁺	Leu-d₃
L-Glutamic acid	y=0.0555x+0.0046	0.9990	0.0020-50.0	＜0.2	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
L-Citrulline	y=0.0993x-0.0579	0.9959	0.0050-50.0	5.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
L-Methionine	y=2.6431x+0.0033	1.0000	0.0005-10.0	＜0.2	[M+H]⁺	Met-d₃
L-Tryptophan	y=3.5425x+0.0785	1.0000	0.0010-25.0	＜0.2	[M+H]⁺	Met-d₃
L-Ornithine	y=0.4010x+0.1674	0.9964	0.0016-39.2	＜0.2	[M+H]⁺	Gln-d₄
Tyrosine	y=2.2095x-0.0333	0.9996	0.0005-25.0	＜0.2	[M+H]⁺	Met-d₃
L-Isoleucine	y=2.5738x-0.2891	0.9967	0.0020-25.0	＜0.2	[M+H]⁺	Leu-d₃
Thymine	y=0.0094x+0.0021	0.9995	0.0500-50.0	50.0	[M+H]⁺	Phe-d₅
L-Aspartate	y=0.0225x-0.0025	0.9999	0.0500-50.0	50.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
L-Homoserine	y=0.1055x+0.1190	0.9924	0.0050-50.0	2.0	[M+H]⁺	Phe-d₅
Arginine	y=3.3753x+0.8679	0.9994	0.0050-50.0	＜0.2	[M+H]⁺	Met-d₃
N-Acetyl-L-aspartate	y=0.0011x-0.0017	0.9970	0.5000-50.0	500.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
L-Methionine sulfoxide	y=0.2088x+0.0990	0.9978	0.0020-50.0	2.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
L-Threonine	y=0.1023x+0.0312	0.9989	0.0030-50.0	3.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
Cytosine	y=2.3537x+2.4399	0.9930	0.0007-50.0	＜0.1	[M+H]⁺	Phe-d₅
Inosine	y=0.1359x+0.0308	0.9987	0.0003-50.0	0.3	[M+H]⁺	Phe-d₅
Guanine 1	y=1.4421x+1.0710	0.9966	0.0010-50.0	＜0.1	[M+H]⁺	Phe-d₅
Guanine 2	y=0.5334x+0.2319	0.9980	0.0003-50.0	0.3	[M+H]⁺	Phe-d₅
Hypoxanthine 1	y=1.7813x+0.2619	0.9985	0.0001-50.0	＜0.1	[M+H]⁺	Phe-d₅
Hypoxanthine 2	y=0.3237x+0.1076	0.9998	0.0001-50.0	＜0.1	[M+H]⁺	Phe-d₅
Guanosine	y=0.7494x+0.2954	0.9981	0.0001-50.0	＜0.1	[M+H]⁺	Phe-d₅
Deoxycytidine	y=0.2933x+0.3579	0.9918	0.0010-50.0	0.3	[M+H]⁺	Phe-d₅
Uridine	y=0.0033x+0.0005	0.9989	0.0130-50.0	13.0	[M+H]⁺	Phe-d₅
Nicotinamide	y=3.0104x+1.1650	0.9980	0.0001-50.0	＜0.1	[M+H]⁺	Phe-d₅
2′-Deoxyguanosine	y=0.0897x+0.0362	0.9944	0.0003-46.8	0.3	[M+H]⁺	Phe-d₅
Glutathione	y=0.2050x-0.0234	0.9999	0.0033-50.0	＜0.1	[M+H]⁺	Gln-d₄
D-Mannitol	y=0.0004x-0.0008	0.9976	1.3300-50.0	1330.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
NADH 1	y=0.0105x+0.0114	0.9960	0.0470-70.1	47.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
NADH 2	y=0.0013x-0.0011	0.9997	0.4700-70.1	470.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
NADP	y=0.0197x+0.0242	0.9937	0.0500-75.0	10.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
FAD	y=0.0369x+0.0169	0.9980	0.0190-69.5	4.6	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
NAD	y=0.0523x+0.0645	0.9943	0.0100-75.0	0.2	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
AMP	y=0.0831x+0.0012	0.9999	0.0040-66.5	4.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
ADP	y=0.0475x+0.0387	0.9966	0.0400-63.9	40.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
ATP	y=0.0311x+0.0181	0.9928	0.4600-69.0	460.0	[M+H]⁺	Leu-d₃
cAMP	y=2.0904x+0.0532	0.9956	0.0010-2.0	0.5	[M+H]⁺	Leu-d₃
dADP	y=0.0430x+0.0285	0.9983	0.1800-67.7	45.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
D-Glusamine-6-phosphate	y=0.0711x+0.0171	0.9975	0.0200-25.0	10.0	[M+H]⁺	L-methionine sulfone
D-Fructose-6-phosphate	y=0.0769x+0.0284	0.9989	0.0400-64.1	8.0	[M-H]^-	L-methionine sulfone
R-Ribose-5-phosphate	y=0.0640x+0.0021	0.9999	0.0410-62.9	17.0	[M-H]^-	L-methionine sulfone
D-fructose-1,6-biphosphate	y=0.0597x-0.3343	0.9803	1.8800-70.4	1880.0	[M-H]^-	L-methionine sulfone
D-glucose-6-phosphate	y=0.1087x-0.0280	0.9998	0.0500-75.0	8.0	[M-H]^-	L-methionine sulfone
Fumaric acid	y=0.5483x-0.7408	0.9965	0.0500-75.0	20.0	[M-H]^-	succinic-d₄
Succinic acid	y=0.2684x+0.0553	0.9998	0.0050-75.0	0.2	[M-H]^-	succinic-d₄
α-Ketoglutaric acid	y=1.5345x+0.3246	0.9997	0.0010-75.0	0.2	[M-H]^-	succinic-d₄
3-Hydroxymyristic acid 1	y=6.5378x+0.6608	0.9997	0.0010-75.0	0.2	[M-H]^-	Phe-d₅
3-Hydroxymyristic acid 2	y=4.0283x+4.1528	0.9920	0.0010-75.0	0.2	[M-H]^-	Phe-d₅
3-Phenylpyruvic acid	y=0.4651x+0.1428	0.9962	0.0200-25.0	10.0	[M-H]^-	Phe-d₅
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid	y=1.1605x-5.2602	0.9951	1.4600-54.8	360.0	[M-H]^-	succinic-d₄
6-Phosphogluconic	y=0.0383x-0.0016	0.9907	2.0000-75.0	50.0	[M-H]^-	L-methionine sulfone
Phosphoenolpyruvic acid	y=1.7996x-2.7532	0.9965	0.2000-75.0	20.0	[M-H]^-	succinic-d₄
Pantothenic acid	y=19.3460x-22.5630	0.9922	0.0050-75.0	1.0	[M-H]^-	succinic-d₄
cis-Aconitic acid 1	y=0.0022x+0.0017	0.9969	2.0000-75.0	2000.0	[M-H]^-	L-methionine sulfone
cis-Aconitic acid 2	y=0.0117x+0.0002	0.9923	0.2000-25.0	200.0	[M-H]^-	L-methionine sulfone
Malic acid	y=0.9370x-1.5115	0.9989	0.5000-75.0	200.0	[M-H]^-	succinic-d₄
Shikimic acid	y=1.7386x+0.4829	0.9976	0.0100-75.0	5.0	[M-H]^-	Phe-d₅
y: peak area ratio of the compound to the internal standard; x: mass concentration,μ g/mL.

2.3.2精密度、准确性与重现性

日内和日间的分析差异被用来验证方法的精密度。日内精密度测试中QC样品一天内连续进样分析6次,85%以上代谢物峰面积的RSD值小于20% ,且其峰面积的累积响应值占全部代谢物总面积的90%以上。日间差异测试中QC样品连续3天进样分析,每天重复分析3次,峰面积RSD值在30%以下的代谢物占全部代谢物的80%以上,其峰面积的累积响应值占总代谢物峰面积的90%以上。

用6个内标的相对回收率考察方法的准确性。QC样品在提取时分别用含低、中、高3个不同浓度内标的提取液和不含内标的空白提取液提取,冻干前,向不含内标的提取物中加入等量的低、中、高浓度内标,每个浓度平行6份样品,内标的相对回收率用提取前加入的内标峰面积与提取后加入的内标峰面积的比值表示,详细结果见表2。可以看出,除正离子模式下Gln-d₄和中浓度下Phe-d₅外,其余内标在正、负离子模式下测得的回收率都在70% ～130%之间,且方法的重复性在可接受范围内(RSD＜20% )。另外，我们平行制备了6份样品,从整体上对方法的重现性进行考察,结果如图3所示，60%以上代谢物峰面积的RSD值小于15% ,峰面积累积响应值占总面积的85%以上,而峰面积RSD值小于30%的代谢物占总代谢物的85%以上。

表2 6个内标物质分别在正、负离子模式下低、中、高3个加标水平的相对回收率(n=6) Table 2 Relative recoveries of six internal standards at low,middle,high levels in ESI⁺and ESI^-(n=6)

图3 (a)正离子模式下和(b)负离子模式下方法的重现性 Fig.3 Reproducibility of the method in (a) ESI⁺and (b) ESI^-

2.3.3样品的稳定性

4 ℃条件下同一份样品分别在复溶后0、4、8、12、18、24 h进样分析考察样品的稳定性。结果显示85%以上的代谢物峰面积的RSD值小于30% ,说明在24 h内大部分样品具有良好的稳定性。

2.4 方法应用

基于所建立的方法分别在正、负离子模式下对W、Y+和Y- 3株基因改造的大肠杆菌代谢组进行分析。使用XCMS对采集到的大肠杆菌代谢谱信息进行峰匹配,正、负离子模式下分别识别出 2695 和 1518 个离子信息,所得数据经总峰面积归一化及80%规则去零值后导入SIMCA-P软件,经pareto标尺化后进行PLS-DA模式识别分析。图4a,b显示了W和Y+两株菌的PLS-DA得分图,正离子模式下模型参数R²Y=0.926,Q²=0.814;负离子模式下模型参数R²Y=0.883,Q²=0.657;而且999次随机排列组合测试表明模型没有过拟合,说明模型可靠。图5a,b显示了W和Y-两菌株的PLS-DA模型的分析结果,正、负离子模式下模型参数R²Y分别为0.843、0.862,Q²=0.682、0.78,同样999次随机排列组合测试表明模型可靠。从图4a,b和5a,b可看出W和Y+菌株,W和Y-菌株均可得到很好的区分,说明遗传操作后大肠杆菌代谢谱发生了明显的变化。通过VIP值找出对模型区分贡献大的变量,图4c,d分别为正、负离子模式下W,Y+两株菌PLS-DA模型的S-plot图,图5c,d为W和Y-菌株PLS-DA模型的S-plot图,图中红色三角标注的为VIP＞1的变量,这些变量经非参数检验后,p值小于0.05的认为是潜在的差异物质。经过数据库检索及二级质谱信息匹配,W与Y+菌株间鉴定出其中20个差异物质,W与Y-菌株间鉴定出29个差异物质,结果见表3和表4。

图4 (a)正离子模式和(b)负离子模式下W与Y+菌株的PLS-DA得分图及相应的(c)正离子模式和(d)负离子模式的S-plot图 Fig.4 PLS-DA score plots and S-plots between W and Y+ strains in (a,c) ESI⁺ and (b,d) ESI^-

图5 (a)正离子模式和(b)负离子模式下W与Y-菌株的PLS-DA得分图及相应的(c)正离子模式和(d)负离子模式的S-plot图 Fig.5 PLS-DA score plots and S-plots between W and Y- strains in (a,c) ESI⁺ and (b,d) ESI^-

从表3和表4可看出,大部分小肽在Y+菌株中是上调的,而在Y-菌株中是下调的。大部分脂在Y-菌株中也是下调的。鸟嘌呤和鸟苷在Y+菌株中是上调的,黄嘌呤和次黄嘌呤在Y+菌株下调,而次黄嘌呤和黄苷在Y-菌株中含量较高。一些氨基酸如脯氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸在Y-菌株中下调,而参与泛酸和CoA合成途径的物质如 β -丙氨酸、泛酸在Y-菌株中均显著上调。

表3 W和Y+菌株间发生显著变化的代谢物 Table 3 Metabolites changed significantly between W and Y+

表4W和Y-菌株间发生显著变化的代谢物 Table 4Metabolites changed significantly between W and Y- strains

t_R/min	m/z		Mass error/10^-6	Detection mode	VIP	p	Fold change (Y-/W)	Metabolites
t_R/min	Practical	Theoretical	Mass error/10^-6	Detection mode	VIP	p	Fold change (Y-/W)	Metabolites
17.78	245.1132	245.1132	0	[M+H]⁺	15.79	3.23×10^-6	0.42	Pro,Glu
18.09	334.1238	334.1245	2	[M+H]⁺	2.64	8.67×10^-6	0.40	Glu,Gly,Glu
22.88	246.1560	246.1561	0	[M+H]⁺	1.01	3.86×10^-5	0.59	Arg,Ala
19.33	360.1404	360.1401	0	[M+H]⁺	2.35	3.86×10^-5	0.48	Pro,Asp,Glu
21.99	262.1499	262.1510	4	[M+H]⁺	3.31	6.59×10^-5	0.68	Ser,Arg
16.83	262.1034	262.1034	0	[M+H]⁺	5.08	1.83×10^-4	0.67	Glu,Gly,Gly
24.25	329.1929	329.1932	0	[M+H]⁺	3.68	6.53×10^-4	0.56	Gly,Pro,Arg
23.30	276.1553	276.1554	0	[M+H]⁺	1.91	1.02×10^-3	0.76	Lys,Glu
16.84	133.0604	133.0608	2	[M+H]⁺	1.62	4.12×10^-3	0.77	glycyl-glycine
18.59	205.0811	205.0819	3	[M+H]⁺	4.42	1.99×10^-2	0.80	Glu,Gly
23.07	319.1719	319.1724	1	[M+H]⁺	1.81	1.31×10^-4	1.49	Ser,Arg,Gly
11.47	116.0704	116.0706	1	[M+H]⁺	4.56	1.58×10^-3	0.69	L-proline
18.59	148.0604	148.0604	0	[M+H]⁺	1.67	4.16×10^-2	0.81	L-glutamate
8.96	148.0438	148.0438	0	[M-H]^-	1.93	4.79×10^-4	0.73	L-methionine
8.14	90.0547	90.0550	2	[M+H]⁺	2.38	7.14×10^-6	2.27	β-alanine
4.66	377.1441	377.1456	3	[M+H]⁺	1.87	3.16×10^-3	1.26	riboflavin
17.70	365.0472	365.0493	5	[M+H]⁺	1.26	1.42×10^-2	1.22	XMP
18.75	744.0796	744.0827	4	[M+H]⁺	2.40	2.22×10^-2	1.23	NADP⁺
5.01	137.0456	137.0458	1	[M+H]⁺	7.87	3.06×10^-2	1.06	hypoxanthine
8.17	218.1038	218.1034	1	[M-H]^-	8.69	4.81×10^-6	2.11	pantothenic acid
10.99	283.0686	283.0684	0	[M-H]^-	1.41	1.26×10^-2	1.22	xanthosine
4.30	702.5101	702.5079	3	[M-H]^-	4.22	1.02×10^-3	1.12	PE(16∶0/17∶1)
4.40	662.4785	662.4766	2	[M-H]^-	3.71	7.84×10^-5	0.70	PE(14∶0/16∶0)
4.17	742.5371	742.5392	2	[M-H]^-	2.44	2.98×10^-4	0.82	PE(18∶1/18∶1)
4.20	714.5071	714.5079	1	[M-H]^-	3.81	2.41×10^-3	0.82	PE(16∶1/18∶1)
1.94	693.4689	693.4712	3	[M-H]^-	3.26	5.35×10^-3	0.64	PG(14∶0/16∶0)
5.65	478.2934	478.2939	0	[M-H]^-	1.49	2.22×10^-2	0.83	LPE(18∶1)
5.74	450.2628	450.2620	0	[M-H]^-	1.75	2.48×10^-2	0.82	LPE(16∶1)
4.27	686.4754	686.4766	1	[M-H]^-	1.33	3.77×10^-2	0.82	PE(16∶1/16∶1)
XMP: xanthosine-5′-monophosphate; NADP⁺: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; PE: phosphatidylethanolamine; PG: phosphatidylglycerol.

表4W和Y-菌株间发生显著变化的代谢物 Table 4Metabolites changed significantly between W and Y- strains

3 结论

本实验比较了4根亲水色谱柱,并优化了盐浓度、pH值、样品复溶溶剂条件,建立了一种亲水作用色谱/质谱联用方法。该方法可以检测到包括氨基酸、有机酸、核苷酸、磷酸糖、磷脂、小肽等各种极性物质。方法验证结果表明此方法有较宽的线性范围,日内、日间精密度及重现性良好,85%以上代谢物峰面积的RSD值小于30% 。另外，6个内标物质的相对回收率结果表明，方法的准确性在可接受范围内,且其日内精密度(RSD)均小于20% 。本文建立的方法不仅可以用于大肠杆菌代谢组分析,而且对其他样本体内极性物质的分离分析有潜在的应用价值。

参考文献

[1]	Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. Xenobiotica, 1999, 29(11): 1181
[2]	Fiehn O. Plant Mol Biol, 2002, 48(1/2): 155
[3]	Altmaier E, Emeny R T, Krumsiek J, et al. Psychoneuroendocrinology, 2013, 38(8): 1299
[4]	Chen J, Wang W Z, Lv S, et al. Anal Chim Acta, 2009, 650(1): 3
[5]	He H B, Shi X Z, Chen J, et al. Chinese Journal of Chromatography (和红兵, 石先哲, 陈静, 等. 色谱), 2012, 30(3): 245
[6]	Yu X W, Wu Q, Lü W, et al. Chinese Journal of Chromatography (余欣尉, 吴谦, 吕望, 等. 色谱), 2013, 31(7): 691
[7]	Zhou J, Zhang L, Chang Y W, et al. J Proteome Res, 2012, 11(8): 4351
[8]	Zeng J, Kuang H, Hu C X, et al. Environ Sci Technol, 2013, 47: 7457
[9]	Chen M J, Zhou K, Chen X J, et al. Toxicol Sci, 2014, 138(2): 256
[10]	Gu Y, Zhang Y F, Shi X Z, et al. Talanta, 2010, 81(3): 766
[11]	Ohashi Y, Hirayama A, Ishikawa T, et al. Mol Biosyst, 2008, 4(2): 135
[12]	Wang Q Z, Wu C Y, Chen T, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 70(2): 151
[13]	Li Y, Cao Z A. Journal of Chemical Industry and Engineering (李寅, 曹竹安. 化工学报), 2004, 55(10): 1574
[14]	Sprenger G A. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(4): 739
[15]	Janen H J, Steinbüchel A. Biotechnol Biofuels, 2014, 7(7), DOI:10.1186/1754-6834-7-7
[16]	Shah P, Chiu F S, Lan J C W. J Biosci Bioeng, 2014, 117(3): 343
[17]	Zhu L W, Li X H, Zhang L, et al. Metab Eng, 2013, 20: 9
[18]	Bennett B D, Kimball E H, Gao M, et al. Nat Chem Biol, 2009, 5(8): 593
[19]	Garcia D E, Baidoo E E, Benke P I, et al. Curr Opin Microbiol, 2008, 11(3): 233
[20]	Wittmann C. Microb Cell Fact, 2007, 6(6), DOI:10.1186/1475-2859-6-6
[21]	Buscher J M, Czernik D, Ewald J C, et al. Anal Chem, 2009, 81(6): 2135
[22]	Bajad S U, Lu W, Kimball E H, et al. J Chromatogr A, 2006, 1125(1): 76
[23]	Preinerstorfer B, Schiesel S, Lammerhofer M, et al. J Chromatogr A, 2010, 1217(3): 312
[24]	Yuan M, Breitkopf S B, Yang X, et al. Nat Protoc, 2012, 7(5): 872
[25]	Wang X Y, Xie Y P, Gao P, et al. Anal Biochem, 2014, 451: 48
[26]	Smith C A, Elizabeth J, O'Maille G, et al. Anal Chem, 2006, 78(3): 779