色谱  2014, Vol. 32 Issue (10): 1094-1103   (976KB)    
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丁俊
蒋丽
冯钰锜
基于在线富集与原位衍生技术的植物组织中内源性油菜素甾醇的超高效液相色谱-串联质谱分析方法
丁俊1,2, 蒋丽1, 冯钰锜1     
1. 生物医学分析化学教育部重点实验室, 武汉大学化学与分子科学学院, 湖北 武汉 430072;
2. 中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室, 中国科学院武汉植物园, 湖北 武汉 430074
收稿日期：2014-8-13
基金项目：国家自然科学基金项目（91017013，91217309）.
通讯作者：Tel：（027）68755595，冯钰锜，E-mail：yqfeng@whu.edu.cn
摘要：油菜素甾醇是一类重要的植物激素，对植物的生长发育过程起显著调节作用。已报道的油菜素甾醇分析方法存在样品前处理过程复杂和灵敏度低等问题。本研究采用C18 PEEK管填充柱为富集柱，以4-N，N-二甲氨基苯硼酸为衍生试剂，搭建了基于双泵-双六通阀的在线管内固相微萃取-超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）联用系统，对油菜素甾醇进行在线富集和原位衍生，实现植物组织中内源性油菜素甾醇的自动化分析。该系统程序化地控制了油菜素甾醇的进样、萃取、衍生、分离和检测过程，有效简化前处理过程，节省人力；在线富集步骤实现了样品溶液大体积进样，提高样品利用率；原位衍生改善了油菜素甾醇电喷雾的离子化效率，使油菜素甾醇的电喷雾质谱检出限降低至pg/mL。该系统可在300 mg鲜重植物组织中检测到内源性油菜素甾醇，已成功用于水稻、油菜中多种油菜素甾醇的定量分析。
关键词： 在线富集     原位衍生     超高效液相色谱-串联质谱     油菜素甾醇     植物组织    
An automatic and sensitive method for the determination of endogenous brassinosteroids in plant tissues by an online trapping-in situ derivatization-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry system
DING Jun1,2, JIANG Li1, FENG Yuqi1     
1. Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine (Ministry of Education), College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China;
2. Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Wuhan Botanical Garden of Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, China
Received: 2014-8-13
Abstract: Brassinosteroids (BRs) are a class of naturally occurring phytohormones with polyhydroxy steroid structure, which regulate general plant growth and many physiological processes. The reported methods for BR analysis were complicated, and the detection sensitivity was relatively low. To realize the automatic analysis of trace BRs in limited plant tissues, an in-tube solid phase microextraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPME-UPLC-MS/MS) system was constructed based on two valves-two pumps. Using C18 PEEK column as the trapping column and 4-(dimethylamino)phenylboronic acid (4-DMAPBA) as the derivatization reagent, an on line trapping and in situ derivatization assay method of BRs was developed. BRs could be programmed to fulfill the procedures of injection, extraction, derivatization, LC separation and MS detection in the system. The detection limits of BRs were improved more than one order of magnitude by the online trapping and in situ derivatization techniques, thus endogenous BRs could be quantified in only 300 mg plant tissues.
Key words: online trapping     in situ derivatization     ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     brassinosteroid     plant tissues    

油菜素甾醇(brassinosteriods,BRs)是一类重要的植物激素,自20世纪70年代发现以来,人们已鉴定了超过50多种天然的油菜素甾醇[1, 2, 3]。BRs在植物的生长发育过程中发挥了至关重要的作用,调控着细胞伸长分裂、维管束分化、种子萌发、生根、花粉管形成等多项生理学过程,能显著提高植物对环境胁迫的抵抗能力[4, 5]。目前,油菜素甾醇的合成、代谢路径和信号传导机理还未完全探明,监控植物中油菜素甾醇含量的变化对相关机理研究具有重要的指导意义。然而,内源性油菜素甾醇含量低、植物样品基质复杂,现有分析方法多数难以满足植物学家对BRs分析检测的要求。

为了实现油菜素甾醇的检测,分析化学工作者开发了基于酶联免疫法[6, 7, 8]、气相色谱-质谱联用[9, 10]、高效液相色谱与紫外-可见检测器/荧光检测器或串联质谱联用的多种分析方法[8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19]。其中,液相色谱-串联质谱联用技术是目前主流的检测手段。虽然油菜素甾醇在大气压化学电离(APCI)源和电喷雾电离(ESI)源质谱上均可产生响应信号,但检出限较高,不能满足少量植物样品中痕量油菜素甾醇的分析需求[8]。有研究以丹酰-3-氨基苯硼酸[20, 21]、2-溴-吡啶-5-硼酸[21]、3-氨基苯硼酸[22]、3-N,N-二甲氨基苯硼酸[23]衍生油菜素甾醇,通过引入易电离的氨基或吡啶基团,提高了衍生产物的电喷雾质谱离子化效率,将检出限降低至fg级。然而,上述衍生反应需要加入毒性大的吡啶作为催化剂,且反应时间较长。另外,柱前衍生法引入了额外的步骤,增加操作的繁琐程度。

原位衍生技术在过去的20年内引起了广泛的关注[24, 25],可与多种样品前处理技术联用[26, 27, 28, 29, 30, 31]。该技术将分析物预先富集于萃取介质上,不需经过耗时的解吸、吹干及重新溶解过程,可直接与衍生试剂发生原位衍生反应,因此有效简化了样品处理步骤,降低了样品制备过程中可能引起的人为误差。此外,分析物在萃取介质表面的局部浓度高,有利于提高衍生反应效率,进而可缩短反应时间。

管内固相微萃取(in-tube SPME)是一种固相微萃取与液相色谱仪在线联用的模式[32]。早在2004年,作者所在课题组[33]以聚合物整体柱为富集柱,构建了一套基于双泵-双六通阀的in-tube SPME-HPLC联用系统,目前已得到广泛的应用[33, 34, 35, 36, 37, 38, 39]。该系统不仅配置简单,还可自动化控制进样、萃取、分离和检测过程。更值得注意的是,采用大体积进样技术能实现在线富集,进样量可以从微升级提高至毫升级,改善样品的利用率。

本文中,我们将原位衍生技术与in-tube SPME结合,搭建了双泵-双六通阀的in-tube SPME-UPLC-MS/MS联用系统,实现了油菜素甾醇的在线富集与原位衍生自动化分析。基于该方法,植物组织中油菜素甾醇分析的灵敏度提高了两个数量级,在300 mg植物中即可实现内源性油菜素甾醇的准确定量。

1 实验部分
1.1 试剂

油菜素甾醇标准品:28-去甲基油菜素内醇(28-norbrassinolide,28-norBL)、28-去甲基油菜素甾酮(28-norcastasterone,28-norCS)、油菜素内酯(brassinolide,BL)、油菜素甾酮(castasterone,CS)、28-高油菜素内酯(28-homobrassinolide,28-homoBL)以及两种稳定同位素内标D3-BL和D3-CS均购自Olchemim公司(Olomouc,捷克)。

甲酸(纯度88% )、无水硫酸镁(分析纯)、氯化钠(分析纯)和甲酸铵(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司(上海,中国)。4-N,N-二甲氨基苯硼酸(4-DMAPBA)购自百灵威科技有限公司(北京,中国)。甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)均购自Tedia公司(Fairfield,OH,美国)。实验用去离子水由Milli-Q系统(Bedford,MA,美国)制备。

HiCapt石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶(GCB/PSA键合硅胶,500 mg/100 mg)双层固相萃取小柱(6 mL)、HiCapt C18硅胶和HiCapt强阳离子交换混合模式硅胶(MCX)均购自维泰克科技有限公司(武汉,中国)。

1.2 植物材料

生长时间为90 d的野生型油菜收集自中国农业科学院油料作物研究所的实验田中。红莲裕泰A型水稻和红莲裕泰B型水稻种植于武汉大学生命科学院的试验田中,采摘生长3个月的水稻叶片和花穗。上述样品一经采摘,立即冻存于液氮中,准确称取300 mg样品装入自封袋中,置于-80 ℃超低温冰箱中储存。

1.3 双层柱固相萃取-在线富集-原位衍生-高效液相色谱-串联质谱联用法

植物样品(300 mg鲜重)在液氮中冷冻研磨至粉末状,转移到5 mL聚乙烯离心管中。加入3 mL乙腈和同位素内标D3-BL、D3-CS各0.5 ng,涡旋均匀后于-20 ℃冰箱内过夜提取。粗提液经过冷冻离心(3500 g,-4 ℃,10 min)后,所得的上清液以本课题组发展的双层柱固相萃取法除杂[40]。加入氯化钠(250 mg/g)和无水硫酸镁(1 g/g),涡旋1 min充分去除提取液中的水分。离心(3500 g,-4 ℃,10 min)后,上清液通过GCB/PSA硅胶填充的双层固相萃取小柱(预先以3 mL乙腈活化),收集上样流出液;再以乙腈/甲醇(1/1,v/v,2 mL)解吸液洗脱固相萃取柱上吸附的油菜素甾醇。所得的上样流出液和解吸液合并后,在35 ℃下以缓慢氮气流吹干,重新溶解于甲醇-水溶液(3/7,v/v,1 mL)中并转移到1.5 mL自动进样瓶内。配制4-DMAPBA的水溶液(500μ g/mL,500μ L)于1.5 mL自动进样瓶中,待用。

在线富集-原位衍生系统采用C18 PEEK管柱(5 cm×0.76 mm i. d.,5μ m,自填装)为富集柱。在线富集-原位衍生步骤如下:携带液(乙腈)在泵C的驱动下以0.02 mL/min 的流速通过富集柱;同时,自动进样器吸取600μ L样品溶液注入定量环(500μ L)中;接着,六通阀A由LOAD状态切换到INJECT状态,此时,携带液推动样品溶液从定量环中进入富集柱,在线富集开始;25 min后,500μ L样品溶液通过富集柱,上样过程完成,停止系统;自动进样器再次吸入300μ L衍生试剂溶液,进样完成后再次切换阀A至INJECT状态并开启泵C,继续让携带液推动衍生试剂溶液通过富集柱,油菜素甾醇和4-DMAPBA在富集柱的柱头相遇并发生原位衍生反应;10 min后,控制六通阀B由LOAD状态切换至INJECT状态,二元泵(泵A和泵B)驱动流动相以0.03 mL/min 的流速通过富集柱,将捕获的油菜素甾醇衍生产物解吸到色谱柱上;经过15 min的解吸,六通阀B切换回LOAD状态,流动相流速升至0.2 mL/min,各衍生产物经过色谱分离,进入串联质谱分析;在色谱分离的同时,携带液乙腈持续通过富集柱清洗可能的残留及植物基质,为下一次分析做准备;整个富集、衍生、分离、检测步骤均由程序自动化控制,程序设置见表1。

1.4 UPLC-ESI-MS/MS仪器和分析条件

在线富集、原位衍生及色谱分离过程在Shimadzu 8040 LC-MS系统上完成。该系统包括两台LC-30AD高压输液泵(binary pumps)、一台LC-10A高压输液泵(pump C)、一台DGU-20A5R脱气机、一台SIL-30AC型自动进样器、一台CTO-30A型柱温箱以及一台Shimadzu 8040三重四极杆串联质谱仪。

色谱分离条件:采用Shim-pack ODS色谱柱(75 mm×2.0 mm,1.6μ m,Shimadzu,Japan)分离5种油菜素甾醇衍生产物;流动相为乙腈与含0.1%(v/v)甲酸的水溶液以体积比85/15在线混合;流速为0.2 mL/min,柱温40 ℃;进样量20μ L。

质谱条件:采用正离子模式,在多反应监测(MRM)模式下对各分析物进行定量。优化后的电喷雾离子源条件如下:脱溶剂(DL)管温度250 ℃,加热模块温度400 ℃,雾化气流速3 L/min,干燥器流速15 L/min。其他MRM模式质谱参数见表2。数据采集和数据后处理均由labsolution软件完成(version 5.53 sp2,Shimadzu,Tokyo,Japan)。

表1 在线富集、原位衍生及分离步骤的控制程序 Table 1 Program of online trapping,in situ derivatization and separation

表2 7种油菜素甾醇衍生产物UPLC-ESI-MS/MS多反应监测模式的最优参数 Table 2 Optimized MRM parameters of seven BR derivatives by UPLC-ESI-MS/MS

图1 油菜素甾醇BL与4-DMAPBA的反应 Fig.1Reaction of brassinosteroid with 4-(dimethylamino)phenylboronic acid (4-DMAPBA)
2 结果与讨论
2.1 在线富集-原位衍生系统工作条件的优化
2.1.1衍生试剂的选择

硼酸与顺式羟基的亲和反应早有报道[41]。4-DMAPBA含有反应基团硼酸、疏水性间隔臂苯环及易离子化基团叔氨基,可增强离子化效率,提高油菜素甾醇的疏水性,进而改善分析物的色谱分离行为和质谱检测灵敏度。因此,我们选择4-DMAPBA为衍生试剂。其与油菜素甾醇BL的反应见图1,侧链和甾环上的两对羟基同时反应,生成双4-DMAPBA的衍生产物。其中,衍生产物甾环上的硼-氧五元杂环位阻小,一旦进入酸性流动相中便迅速分解,因此只能检测到油菜素甾醇的单4-DMAPBA衍生产物[20]。

2.1.2在线富集-原位衍生联用模式的选择

原位衍生与在线富集联用不仅能改善方法的灵敏度,还可以简化繁琐的衍生化过程,实现样品前处理的自动化操作。富集柱既是吸附介质,也作为微反应器。通常,样品前处理技术与原位衍生联用包括两种模式:①衍生试剂先富集于吸附剂上,然后以该材料萃取并衍生样品溶液中的目标分析物,称为萃取与衍生同时进行;②先富集目标分析物,再引入衍生试剂溶液与材料上吸附的目标分析物进行衍生反应,称为先萃取后衍生。我们采用4-DMAPBA为衍生试剂,对比了两种模式的效果。结果见图2,两种模式均能监测到油菜素甾醇的衍生产物,但与模式①相比,采用先萃取后衍生的模式②时5种油菜素甾醇衍生产物的峰面积更大,可见该模式在提高油菜素甾醇的检测灵敏度方面更具优势。我们推测其原因可能是先富集衍生试剂,强极性的4-DMAPBA在C18富集柱柱头的富集效率不高,所吸附的衍生试剂总量有限,导致衍生效率下降。而先富集目标分析物后衍生模式中,油菜素甾醇的疏水性强,富集效率高,当衍生试剂通过富集柱时,能迅速地与吸附的油菜素甾醇反应。根据上述结论,我们在后续实验中选择先富集后衍生的模式。

图2 在线富集-原位衍生模式的比较 Fig.2 Comparison of both modes of online trapping-in situ derivatization Sampling solution: 30%(v/v)methanol aqueous solution spiked with 5 BRs at 1 ng each; derivatization solution: 500μ g/mL 4-DMAPBA aqueous solution; trapping column: Home-packed C18 PEEK column.
2.1.3在线富集柱的选择

鉴于油菜素甾醇的4-DMAPBA衍生产物同时含有疏水基团和碱性基团,我们选择C18键合硅胶和强阳离子交换混合模式硅胶作为在线富集柱的填料,对比两者的在线富集-原位衍生效果。如图3所示,两种填料对28-norBL和28-norCS的富集效果类似,而采用C18键合硅胶为吸附剂时,BL、CS、28-homoBL的峰面积显著提高,可见C18 PEEK管柱作为在线富集柱的效果更佳。基于上述结果,在线富集及原位衍生均在C18 PEEK管柱上完成。

图3 富集柱填料的比较 Fig.3 Comparison of sorbents of trapping column Sampling solution: 30%(v/v)methanol aqueous solution spiked with 5 BRs at 1 ng each; derivatization solution: 500μ g/mL 4-DMAPBA aqueous solution; mode: online trapping of BRs followed by in situ derivatization.
2.2 在线富集-原位衍生的条件优化

为了达到最佳的萃取效果及衍生效率,我们在搭建好的在线富集-原位衍生平台上进行条件优化,所考察的参数包括:油菜素甾醇上样液的有机相含量,4-DMAPBA的浓度、上样体积及有机相含量,上样流速,解吸液体积。

油菜素甾醇含疏水性分子骨架,在纯水中溶解度差;而C18富集柱与油菜素甾醇之间通过疏水作用保留,上样液中有机溶剂含量增加会影响油菜素甾醇的萃取效率。我们向油菜素甾醇上样液中添加不同含量的甲醇,考察有机溶剂含量对富集效率的影响。如图4所示,油菜素甾醇上样液中的有机溶剂体积分数由10%增加到30% ,5种油菜素甾醇衍生产物的峰面积逐渐增加;从30%增加至50% ,各产物峰面积基本不变。这可能是由于油菜素甾醇在有机溶剂体积分数低于30%的溶液中溶解度差,有机溶剂含量越低,进样瓶壁对油菜素甾醇的吸附越严重,造成萃取效率低。而有机溶剂体积分数即使增大至50% ,油菜素甾醇在C18富集柱上仍有很强的保留。因此,后续实验中选择以30%(v/v)甲醇水溶液溶解油菜素甾醇样品。

图4 上样液中甲醇体积分数对上样效果的影响 Fig.4 Effect of methanol volume percentage in BRs sampling solution Sampling solution: methanol aqueous solution spiked with 5 BRs at 1 ng each; derivatization solution: 500μ g/mL 4-DMAPBA aqueous solution; mode: online trapping of BRs followed by in situ derivatization.

衍生试剂用量会影响油菜素甾醇与4-DMAPBA的反应效率。用量过少,衍生反应不充分;用量过多,容易导致衍生试剂的色谱峰展宽严重甚至与衍生产物同时洗脱,抑制分析物的离子化效率。此外,若大量的衍生试剂进入UPLC-MS/MS系统,容易污染色谱和质谱系统,缩短仪器的维护周期。我们对衍生试剂的用量进行了考察,分别评价了不同浓度及不同体积的4-DMAPBA对衍生效率的影响。结果如图5所示, 衍生化试剂的进样量从50μ L增加到100μ L，5种BRs峰面积逐渐增加，随后达到平台，我们选择衍生化试剂的进样量为200μ L。5种BRs的峰面积随着衍生化试剂的浓度增加不断变大，考虑到衍生化试剂浓度过高容易污染质谱，我们选择的衍生化试剂质量浓度为500μ g/mL。

图5 衍生溶液的(a)体积和(b)质量浓度对原位衍生效率的影响 Fig.5 Effects of (a) volume and (b) concentration of4-DMAPBA derivatization solution on derivatization efficienciesSampling solution: 30%(v/v)methanol aqueous solution spiked with 5 BRs at 1 ng each; derivatization solution: 4-DMAPBA aqueous solution; mode: online trapping of BRs followed by in situ derivatization.

接着,向衍生试剂溶液中添加不同含量的甲醇,考察有机溶剂含量对衍生效率的影响。如图6所示,随着衍生溶液中的有机溶剂体积分数由0增加到50% ,5种油菜素甾醇衍生产物的峰面积急剧下降。这是由于4-DMAPBA疏水性较弱,有机溶剂含量增加导致其在C18富集柱上的保留减弱,从而使其与柱头上富集的油菜素甾醇接触时间很短,降低衍生反应效率。为了保证较高的衍生效率,我们在后续实验中采用纯水配制衍生试剂溶液。

图6 衍生试剂溶液中甲醇的体积分数对衍生效率的影响 Fig.6 Effects of methanol volume percentages inderivatization solution on derivatization efficiency Sampling solution: 30%(v/v)methanol aqueous solution spiked with 5 BRs at 1 ng each; derivatization solution: 500μ g/mL 4-DMAPBA solution added with different proportions of methanol; mode: online trapping of BRs followed by in situ derivatization.

图7 上样流速对油菜素甾醇衍生效率的影响 Fig.7Effect of flow rate on the efficiency of BR derivatization Sampling solution: 30%(v/v)methanol aqueous solution spiked with 5 BRs at 1 ng each; derivatization solution: 500μ g/mL 4-DMAPBA solution; mode: online trapping of BRs followed by in situ derivatization.

为了探索最佳的上样流速,我们考察了流速在20～100μ L/min 范围内萃取效率和衍生效率的变化情况,结果如图7所示。5种油菜素甾醇的峰面积随着流速增大逐渐降低。这说明流速过快会降低油菜素甾醇的萃取效率和原位衍生效率。因此我们选择携带液的流速为20μ L/min。

在线富集和原位衍生完成后,控制程序自动切换阀B为INJECT状态,流动相进入富集柱开始解吸。理想的流动相组成既需要提供良好的色谱分离条件,又能有效地将油菜素甾醇衍生产物从富集柱上洗脱下来。85%(v/v)乙腈-水(含0.1%(v/v)甲酸)可提供良好的色谱分离条件,我们以此流动相为解吸液,考察了解吸时间分别为5、10、15、20 min时的解吸效果。结果表明,在0.03 mL/min 的流速下,15 min可基本将油菜素甾醇衍生产物解吸完全。因此,后续实验固定解吸时间为15 min。

我们以萃取时间曲线考察C18富集柱对油菜素甾醇的富集能力。固定5种油菜素甾醇标准溶液浓度为10 ng/mL,恒定携带液流速为0.02 mL/min,不断增大样品萃取时间(1～17 min),其萃取体积也相应增大,得到萃取时间与油菜甾醇峰面积的关系图。结果如图8所示,油菜素甾醇的萃取量随着萃取时间的增加呈线性增长趋势,上样量达到17 ng(上样时间17 min),仍未达到萃取平台。这表明C18富集柱对油菜素甾醇有很强的富集能力,能够满足实际样品检测的需要。

图8 油菜素甾醇的萃取时间曲线 Fig.8Equilibrium profile of BRs with online trapping Methanol aqueous solution (30%,v/v) spiked with 5 BRs at 10 ng/mL.

表3 油菜素甾醇直接进样、在线富集和在线富集原位衍生法的灵敏度比较 Table 3 Comparison of LODs of direct injection,onlinetrapping and online trapping-in situ derivatization for BRs
2.3 方法的灵敏度及最低植物用量

在常规液相色谱-质谱系统上,由于进样量的限制,只有少部分样品可进入系统完成分析,限制了方法的灵敏度。引入在线富集系统,大体积的样品被捕集于富集柱上,以流动相解吸可使大部分样品进入分离检测系统,充分利用了样品量。另外,原位衍生技术的引入还可进一步提高检测灵敏度。我们分别以直接进样法、在线富集法和在线富集-原位衍生方法分析了5种油菜素甾醇,对比了3种方法处理后5种油菜素甾醇或衍生产物质谱检测灵敏度的变化情况。由表3中的数据可见,引入在线富集系统,未经衍生的油菜素甾醇检出限大大降低,灵敏度相较于BR直接进样提高3～16倍。原位衍生反应的引入使油菜素甾醇的衍生产物被叔氨基团标记,离子化效率增强；与直接在线富集法相比,灵敏度提高63～17倍。总的来说,在线富集-原位衍生法相较于BRs直接分析法灵敏度提高了50～182倍,检出限降低至0.51～0.97 pg/mL。该结果表明,在线富集-原位衍生系统在提高油菜素甾醇灵敏度方面具有很大优势。

由于某些特殊的植物样品培养困难且样品量有限,进行内源性激素定量分析时,往往需要考虑植物用量的问题。鉴于在线衍生-原位富集法的检测灵敏度很高,我们考察了该方法所需的最低植物用量。首先,以1 g鲜重水稻叶片为样品,我们成功对内源性油菜素甾酮进行了定量。随后,我们降低样品用量,依次测定了500、300和100 mg水稻叶片中的内源性油菜素甾醇。具体结果见图9,在300 mg和500 mg水稻叶片中,均能检测到油菜素甾酮,且定量结果没有明显差异,3次测定结果的相对标准偏差小于17% ;然而,当植物用量降低至100 mg时,内源性油菜素甾醇不能检出。因此,在后续实验中,我们确定植物用量为300 mg鲜重。

图9 检测内源性油菜素甾醇所需的最低样品用量考察(n=3) Fig.9 Investigation of the minimum amount of plant sample required for quantification of BRs (n=3)
2.4 方法学考察
2.4.1工作曲线、定量限与检出限

将5种油菜素甾醇的混合样品依次配成0.002~10.0 ng/mL 的溶液,每份中加入两种同位素内标D3-BL和D3-CS各0.5 ng,进入在线富集-原位衍生-UPLC-MS/MS系统分析,在MRM模式下定量,7种油菜素甾醇的MRM色谱图见图10。以5种油菜素甾醇衍生产物的峰面积与同位素内标峰面积的比值对相应的质量浓度做线性回归处理,得到线性回归方程及相关系数,结果见表4。5种油菜素甾醇在0.002~10.0 ng/mL 范围内工作曲线的线性良好,线性相关系数R高于 0.9865。以3倍和10倍信噪比分别计算检出限和定量限,其检出限为0.51～0.97 pg/mL,定量限为1.69～3.23 pg/mL。

图10 7种油菜素甾醇的多反应监测色谱图 Fig.10MRM chromatograms of seven BRs Peaks:1. 28-norBL; 2. BL; 3. D3-BL; 4. 28-norCS; 5. 28-homoBL; 6. CS; 7. D3-CS.
2.4.2方法的精密度及准确性

为了验证方法的稳定性和准确性,我们向水稻 样品中分别添加0.1、1、5 ng/g的5种油菜素甾醇标准样品,按照1.3节所述方法处理,300 mg鲜重的水稻样品先以双层柱固相萃取法初步除杂,再采用在线富集-原位衍生系统分析。我们分别考察了该方法的日内和日间精密度的相对标准偏差(RSD)以及回收率,结果见表5和表6。向水稻样品中添加3个水平的油菜素甾醇,一天内重复分析4次,所得的分析物的峰面积与内标峰面积比值的RSD值为日内精密度,其RSD值不大于14.3% ;连续3 d测定添加了3个水平油菜素甾醇的水稻样品,所得的分析物的峰面积与内标峰面积比值的RSD值为日间精密度,其RSD值不大于17.3% 。说明该方法的重现性较好。根据上述测定的结果,将分析物的峰面积与内标峰面积的比值带入工作曲线计算回收率。低、中、高3个水平的回收率在79.0% ～110.3%之间,说明该方法准确性好,可用于植物样品中油菜素甾醇的定量。

表4 5种油菜素甾醇的线性关系、检出限和定量限 Table 4 Linear relationships,LODs and LOQs of the BRs

表5 方法的日内和日间精密度 Table 5 Intra- and inter-day precisions of the method

表6 方法的回收率 Table 6 Recoveries of the method
2.5 实际样品检测

在2.3节中,我们已在300 mg鲜重水稻叶(种植周期7 d)中成功检测到内源性的CS。为了证明该方法的普适性,我们又分析了生长周期为90 d的野生型水稻和油菜的叶片、红莲裕泰A型水稻和红莲裕泰B型水稻的叶片、红莲裕泰A型水稻和红莲裕泰B型水稻的花穗,其内源性油菜素甾醇的MRM色谱图见图11。其中,不同品种的水稻叶片和水稻花中仅能检测到CS,油菜叶片中可同时检测到BL和CS,定量结果见表7。

表7 6种植物中内源性油菜素甾醇的含量(n=3) Table 7 Amount of endogenous BR in six plant samples (n=3)

图 11 多种植物组织中内源性油菜素甾醇的多反应监测谱图 Fig.11 MRM chromatograms of endogenous BRs in different plant tissues a. Brassica napus L. shoot; b. Oryza sativa L shoot; c. Oryza sativa L. cv. 9311-A shoot; d. Oryza sativa L. cv. 9311-B shoot; e. Oryza sativa L. cv. 9311-A spikelet; f. Oryza sativa L. cv. 9311-B spikelet.
3 结论

我们以C18填充PEEK管柱为富集柱,4-DMAPBA为衍生试剂,构建了在线富集-原位衍生-UPLC-MS/MS系统,成功建立了内源性油菜素甾醇的分析方法。在线富集的引入实现了样品溶液的大体积进样,原位衍生改善了油菜素甾醇电喷雾的离子化效率,使油菜素甾醇的质谱检测灵敏度提高近两个数量级,检出限达到pg/mL级。通过程序控制,整个萃取、衍生、分离、检测实现了自动化操作,极大地节省了人力。方法学考察表明所建立的方法线性范围宽、稳定性及准确性好。利用该方法,仅需300 mg植物样品即可实现内源性油菜素甾醇的检测。我们设计的系统不仅配置简单,利于推广,还具有极强的兼容性,通过改变富集柱或衍生试剂,可用于其他体系中多种化合物的分析。

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