Ultimate 3000超高效液相色谱-TSQ Vantage三重四极杆串联质谱联用仪(美国Thermo Scientific公司); MS 3 digital漩涡混合器(德国IKA公司); MD 200氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

雷公藤次碱(纯度≥98% ,南通飞宇生物科技有限公司)。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯,氯化钠、无水硫酸镁均为分析纯;OASIS HLB固相萃取小柱:500 mg,6 mL(美国Waters公司)。

标准储备液:称取雷公藤次碱标准品10 mg(精确至0.1 mg)置于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,混匀配制成100 mg/L 的标准储备液。标准中间液:准确移取1 mL标准储备液置于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成1.0 mg/L 的标准中间液。标准工作液:根据需要移取适量的标准中间液,用甲醇-水(1 ∶ 1,v/v)稀释成0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1、2 μ g/L 的标准工作溶液。各种标准溶液避光保存于4 ℃冰箱中。

对未结晶的蜂蜜，用力搅拌均匀。对有结晶析出的蜂蜜，将样品瓶盖塞紧后,置于不超过60 ℃的水浴中温热,待样品全部融化后搅拌,迅速冷却至室温。在融化时必须防止水分挥发^[11]。

称取试样2.0 g(精确至0.01 g)于15 mL具盖离心管中,加入10 mL水,振荡使其溶解(必要时可采用超声、加热及漩涡等方式),待净化。

移取待净化试样于OASIS HLB小柱(使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化)中,弃去流出液,然后用5 mL甲醇-水(1 ∶ 1,v/v)溶液淋洗小柱,弃去流出液,最后用5 mL乙腈洗脱;收集洗脱液于带刻度离心管中,氮吹浓缩至近干,最后用甲醇-水(1 ∶ 1,v/v)定容至2 mL,混匀后经0.22 μ m有机相滤膜过滤后上机分析。

色谱柱:Hypersil GOLD C18柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μ m);柱温:35 ℃;进样量:2 μ L;流速:0.25 mL/min。流动相:A为水溶液,B为含0.15%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脱程序:0～2 min,70%A; 2～5 min,70%A～5%A; 5～10 min,5%A; 10～14 min,70%A。

扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压:+3 500 V;鞘气压力: 207 kPa;辅助气流量: 10 arbitrary units;毛细管温度: 350 ℃;蒸发温度: 300 ℃;碰撞气:氩气(1.5 mTorr)。MRM监测离子对:m/z 868.5/206.0(定量)和868.5/178.0; S-Lens电压:155 V;碰撞电压:41 V和54 V;保留时间:6.17 min。

分别比较了甲醇-水和乙腈-水两种流动相对雷公藤次碱目标分析物的分离效果和离子化程度的影响。结果表明,使用甲醇-水溶液体系时选择离子的色谱峰形和灵敏度均优于乙腈-水溶液体系;在甲醇中加入0.15%甲酸,采用梯度洗脱,有助于离子化和优化峰形。雷公藤次碱的MRM色谱图见图1。

图1

Fig. 1

图1 雷公藤次碱标准溶液(5 μ g/L)的多反应监测色谱图 Fig.1 Chromatogram of wilforine standard solution (5 μ g/L) in MRM mode

将雷公藤次碱标准品溶液采用流动注射直接进样,分别在ESI正离子和负离子模式及APCI正离子和负离子模式下进行扫描,发现在ESI⁺模式下准分子离子[M+H]⁺m/z 868.5的响应值最高,因此采用ESI⁺扫描方式。ESI⁺模式下通过MRM选择相对丰度较高、干扰较小的两个子离子m/z 206.0和m/z 178.0为监测离子,其中丰度最高的子离子m/z 206.0为定量离子。同时优化了S-lens电压、碰撞电压等参数。优化结果见1.7节。

将空白蜂蜜样品按1.4和1.5节进行前处理得到的上机分析液作为标准溶液的稀释液^[12],以目标物的峰面积对质量浓度绘制基质加标标准曲线,其斜率与标准品标准曲线的斜率比率为95.1% 。结果表明经过净化处理后对目标测定物的基质效应影响不明显^[13]。

将1.2节配制的标准工作溶液依次进样,分别以雷公藤次碱的峰面积Y为纵坐标、以相应的质量浓度X( μ g/L)为横坐标作标准曲线。结果表明,目标物在0.01～ 2 μ g/L 范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,线性关系方程为Y=11 727.3X-66.303 8,相关系数r大于0.998。以实际检测时的S/N＞10确定方法的定量限为0.01 μ g/kg。

在0.01、0.05和0.5 μ g/kg 3个添加水平下进行空白加标回收率试验,每个水平重复6次。0.01 μ g/kg 添加水平时目标物的回收率为76.1% ～92.4% ,RSD为7.8% ; 0.05 μ g/kg 添加水平时目标物的回收率为82.3% ～96.2% ,RSD为6.4% ; 0.5 μ g/kg 添加水平时目标物的回收率为76.9% ～85.1% ,RSD为4.0% ,均符合残留检测的要求^[14]。