尿素(urea)别名碳酰二胺,又称脲,国际非专利药品名称为Carbamide,其化学式为CO(NH2)2,结构式见图1a。食品中尿素的来源主要为污染和人为添加,我国《食品添加剂使用标准》(GB 2760-2011)规定尿素不得作为食品工业用加工助剂在生产和经营中使用,但没规定其在食品中限量。目前世界上主要国家和地区对尿素在食品中的使用也大多进行了限制,出台了相关的法规,如欧盟的添加限量为30 g/kg,消费食品中最大用量参考生产指导 量进行;台湾的限量为30 g/kg,但仅限于食品制造或加工必须时使用。
目前食品中尿素的检测方法主要有比色法[1, 2, 3]、高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)[4, 5]、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)[6, 7, 8]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[9]、气相色谱-质谱(GC-MS)联用法[10]、中红外光谱法[11]和电极法[12]等。邓辉萍等[1]和齐国艳等[2]分别采用二乙酰-肟-安替比林法测定淀粉、绿豆芽中的尿素,魏峰等[3]采用二甲氨基苯甲醛法和亚硝酸盐-格里斯试剂法测定牛奶中的尿素,王晓娟等[4]和王余波等[5]分别采用高效液相色谱-紫外检测器法测定黄酒、乳制品中的尿素,Clark等[6]、邢江涛等[7]、Zhang等[8]分别采用HPLC-FLD测定葡萄酒、黄酒、酒精饮料中的尿素,王祖翔等[9]采用HPLC-MS/MS测定食品中的尿素,Dai等[10]采用GC-MS联用法测定牛奶和奶粉中的尿素,杨仁杰等[11]采用中红外光谱检测牛奶中的尿素,Trivedi等[12]采用生物电极法测定牛奶中的尿素。其中,比色法、红外光谱法和电极法灵敏度相对较低;HPLC-UV抗干扰能力强,但由于尿素的极性非常强,在传统液相色谱柱中的保留性差或基本不保留,需用亲水相互作用色谱(HILIC)柱;HPLC-MS/MS灵敏度高,选择性好,适用于复杂基体的检测,但设备昂贵难于普及;HPLC-FLD灵敏度高,抗干扰能力强,对色谱柱和仪器要求比较低,是一种较理想的检测方法,但目前主要用于酒类检测,未见用于其他食品的报道。
基于上述问题,本研究建立了尿素的呫吨醇柱前衍生HPLC-FLD检测方法,本方法的检出限、回收率和精密度均符合相关检测要求,用于实际样品的检测,效果良好。
Agilent 1290液相色谱仪,配有荧光检测器;德国赛多利斯电子天平,感量0.1 mg和0.01 g;均质机(T25,IKA公司);甲醇、三氯甲烷和乙酸均为液相色谱纯;其他试剂均为分析纯,所用水为去离子水;呫吨醇(xanthydrol,CAS No 90-46-0,纯度大于99% )和尿素标准品(CAS No 96-45-7,纯度大于99% )均购自Sigma公司;20 mmol/L 辛烷基磺酸钠水溶液的配制:准确称取4.32 g辛烷基磺酸钠溶于1 L水中,用磷酸调节pH至4.0;呫吨醇衍生剂的配制:准确称取0.1 g呫吨醇于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至100 mL;尿素标准溶液的配制:准确称取尿素标准品100.0 mg,用水溶解并定容至100 mL,获得1 g/L 的标准贮备液;其他浓度的标准溶液在试验中根据需要进行配制。
称取试样5.0 g(精确到0.1 g)于50 mL具塞离心管中,加入20 mL 1%(v/v)乙酸溶液,均质2 min,加入5 mL三氯甲烷,均质2 min,以3 000 r/min 离心3 min,提取上清液,过滤。在盛有残渣的离心管内再加入20 mL 1%乙酸溶液,均质2 min,再离心过滤。合并提取液并用水定容至50 mL,混匀;准确吸取0.5 mL提取液和各级标准工作液(0.2、2、20、200、1 000 mg/L),分别加入2 mL进样瓶中,再依次加入0.4 mL甲醇、50 μ L呫吨醇衍生剂和50 μ L 1%(v/v)盐酸溶液,盖紧瓶盖,混匀,衍生5 min,过0.22 μ m滤膜后,供HPLC测定。
色谱柱:EXTEND-C18(250 mm×4.6 mm,5 μ m);柱温:35 ℃;流动相:20 mmol/L 辛烷基磺酸钠水溶液-乙腈(65 ∶ 35,v/v);流速:1 mL/min;进样量:20 μ L;检测波长:激发波长213 nm,发射波长308 nm。
通过尿素与呫吨醇(结构式见图1b)的分子结构式,推测可能存在2种衍生产物:9-脲基呫吨(N-9H-xanthen-9-ylurea,结构式见图1c)与N,N-二脲基呫吨(N,N-di-9H-xanthen-9-ylurea,结构式见图1d),相对分子质量分别为240与420。将尿素标准品衍生物以连续进样的方式用正离子模式电喷雾四极杆质谱进行全扫描,发现在m/z 241([M+H]+)处有明显峰,在m/z 421([M+H]+)处并没有明显信号响应(见图2)。再采用同样条件,对不同浓度的尿素标准品衍生物进行全扫描,其信号响应值与浓度能够成良好线性。因此,推断在该衍生条件下,尿素标准品的衍生产物为N-9H-xanthen-9-ylurea。
比较了0.5%(v/v)盐酸、1%(v/v)盐酸、2%(v/v)盐酸、10%(v/v)磷酸、25%(v/v)磷酸等酸化条件,结果表明在1%盐酸与2%盐酸酸化条件下,尿素的衍生化程度较高,考虑到尽可能少用化学试剂,选用1%盐酸作为衍生的酸化条件。
尿素的水溶性非常强,本文比较了水、1%乙酸溶液、5%氨水溶液这3种提取溶剂。结果表明1%乙酸溶液的提取效率明显高于另外2种提取溶剂,因此选用1%乙酸溶液作为提取溶剂。
本文研究了甲醇-水、乙腈-水、1%乙酸溶液、20 mmol/L 乙酸铵溶液、20 mmol/L 辛烷基磺酸钠溶液等流动相体系及不同pH条件(pH 5.0、4.0、3.0、2.0),结果表明在pH 4.0条件下,选用20 mmol/L 辛烷基磺酸钠溶液-乙腈(65 ∶ 35,v/v)作为流动相干扰小,峰形尖锐,半峰宽合适,参考保留时间为8.011 min,典型色谱图见图3。
分别取质量浓度为0.2、2、20、200、1 000 mg/L 的尿素标准工作溶液各0.5 mL,分别加入0.4 mL甲醇、0.05 mL 1%盐酸水溶液和0.05 mL衍生化试剂,衍生后分别得到尿素衍生物标准工作溶液。将衍生后的溶液按浓度由低到高依次进样,以对应尿素的质量浓度为横坐标(mg/L),峰面积为纵坐标,得到校正曲线,方程为Y=10.58X-17.747,相关系数为 0.999 5。以3倍信噪比(S/N=3)对应的目标物浓度作为检出限(LOD),以S/N=10对应的目标物浓度作为定量限(LOQ),获得目标物的仪器检出限和定量限,再乘以样品的稀释倍数(10倍),除以称样量,得到方法的检出限为0.5 mg/kg,定量限为1.0 mg/kg。
分别在食用菌、水果等5种罐头中进行添加回收试验,在优化的色谱条件下,按照本方法进行回收试验,从空白与添加谱图看,目标物与基体杂质分离很好,不受基体杂质的干扰。每个浓度平行做6次重复,精密度结果见表1。5种罐头食品的回收率为80.2% ～109.7% ,相对标准偏差为2.05% ～6.53% 。本方法的回收率和精密度均符合残留分析要求。
利用本研究建立的方法对168个实际样品进行测定,其中水果罐头42个、蔬菜罐头52个、肉类罐头34个、食用菌罐头16个、鱼类罐头24个。检测结果表明,仅在3个肉类罐头样品中检出尿素,含量分别为10.6、62.1和2.6 mg/kg,其中一肉类罐头样品的色谱图见图4。
建立了柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测法用于测定罐头食品中的尿素残留。该方法前处理过程简单,具有良好的灵敏度、回收率和重复性,可用于进出口罐头食品中尿素的测定。
2015, Vol. 33 Issue (1): 80-83
PDF (973 KB)
2015, Vol. 33 Issue (1): 80-83
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