色谱  2014, Vol. 32 Issue (12): 1326-1332   PDF (869 KB)    
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王星
池玉梅
康安
超高效液相色谱-串联质谱法定性和高效液相色谱法定量分析天南星中氨基酸成分
王星, 池玉梅 , 康安    
南京中医药大学, 江苏 南京 210023
收稿日期：2014-8-26
基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目(PADA).
通讯作者：池玉梅,E-mail:ymchii@njutcm.edu.cn.
摘要：为建立中药材中氨基类极性非紫外活性成分的定性与定量分析方法,以中药材天南星为研究对象,采用柱前衍生化技术,以异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生化试剂,经C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm)分离和超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析,共解析了天南星中20个成分,包括18个氨基酸和2个胺类化合物。经优化衍生化条件,应用高效液相色谱法(HPLC),以Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)分离,以乙腈和0.05 mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液(pH 6.5)为流动相,梯度洗脱,在254 nm下检测,建立了同时测定15种氨基酸含量的方法,经方法学考察符合含量测定要求。谷氨酸、色氨酸在2~100 mg/L范围内、精氨酸在6~300 mg/L范围内、其余各氨基酸在0.8~40 mg/L范围内均呈良好的线性关系,相关系数均不小于0.9995;平均回收率在95%~105%之间,RSD均小于3%;并成功应用于12批中药材的测定。本方法简便、灵敏、准确,具有可操作性,可用于快速鉴定中药中的氨基类成分以及进行含量测定。
关键词： 柱前衍生化     超高效液相色谱-串联质谱法     高效液相色谱     氨基类成分     天南星     异硫氰酸苯酯    
Qualitative and quantitative analysis of the amino acids in Rhizoma Arisaematis by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and high performance liquid chromatography
WANG Xing, CHI Yumei , KANG An    
Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Received: 2014-8-26
Abstract: A method for the identification and determination of the polar amino components without ultraviolet activity in traditional Chinese medicines was developed. With Rhizoma Arisaematis as the object of this study, using pre-column derivatization with phenyl isothiocyanate (PITC) as the derivatization reagent, compounds were separated and identified on a C18 column (100 mm×2.1 mm, 3.5 μm) by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). A total of 20 components, including 18 amino acids and 2 amine compounds were identified. Furthermore, after the optimization of the derivatization conditions, 15 amino acids were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) on Diamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), detected at 254 nm and gradiently eluted by acetonitrile and 0.05 mol/L ammonium acetate-acetic acid (pH 6.5) as the mobile phases. The results of methodological study demonstrated that the method can meet the requirements of the determination. All calibration curves expressed good linearity: Glu, Try in the range of 2-100 mg/L, Arg in the range of 6-300 mg/L, others in the range of 0.8-40 mg/L, with the correlation coefficients ≥ 0.9995. The average recovery of this method was among 95%-105% and the RSD was less than 3%. The developed method was successfully applied to quantitative determination of amino compounds in 12 batches of Rhizoma Arisaematis samples. The method is simple, sensitive, accurate, and can be used for rapid identification and determination of amino components in traditional Chinese medicines.
Key words: pre-column derivatization     ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)     high performance liquid chromatography (HPLC)     amino compounds     Rhizoma Arisaematis     phenyl isothiocyanate (PITC)    

随着色谱-质谱(LC-MS)联用技术的日益发展,复杂中药体系中的一些成分已实现了在线检测与快速鉴别[1, 2, 3]。然而对于极性非紫外活性成分如含氨基、羧基类化合物的定性、定量分析方法的研究迄今报道尚少见。鉴于目前高效液相色谱法(HPLC)主要采用C18色谱柱进行分离,为使化合物易于紫外或荧光检测和具有质谱解析的特征离子,并使化合物具有疏水性可在C18色谱柱上保留以便实现分离,本文拟采用柱前衍生化技术。

中药材天南星为天南星科植物天南星(Arisaema erubescens (Wall.) Schott.)、异叶天南星(A. heterophyllum Blume.)、东北天南星(A. amurense Maxim.)的干燥块茎,具有燥湿化痰、祛风止痉、散结消肿之功效,临床用于肿瘤治疗,分析研究主要针对黄酮类及核苷类等具有紫外吸收的成分[4, 5]。

异硫氰酸苯酯(PITC,C7H5NS)可与一级、二级氨基发生反应,且反应条件温和、操作简单、产物稳定,故常作为氨基类成分定性、定量分析的衍生化试剂[5]。

本论文将以中药材天南星为研究对象,以PITC为衍生化试剂,通过柱前衍生化,采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)对天南星中氨基类成分的衍生化产物进行分析,以期通过研究解析规律,为中药成分快速鉴定开拓方法;并提供简便快速的定量分析方法,为中药质量控制提供研究依据。

1 实验部分
1.1 仪器与试药

仪器:质谱仪(Q-TOF 5600,美国AB公司),配电喷雾离子源(ESI,美国AB公司);超高效液相色谱仪(日本岛津公司),配PeakView 1.2软件;高效液相色谱仪(Waters Alliance 2695),配Waters 2489紫外检测器(美国Waters公司)和Empower软件。

试剂:PITC(标示纯度为98% ,Aladdin公司);乙腈为色谱纯;醋酸、醋酸铵、三乙胺皆为分析纯。

氨基酸对照品:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)、赖氨酸(Lys),均来自BIO BASIC INC(含量＞98.5% )。

12批天南星药材经南京中医药大学植物资源专家谈献和教授鉴定为正品,药材来源及品种见表1。

表 1 天南星药材样品 Table 1 Rhizoma Arisaematis samples

1.2 分析条件
1.2.1 UHPLC条件

参考文献[7]并经优化后确定的条件为:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m);柱温30 ℃;流动相A为0.01%(v/v)甲酸水溶液,B为乙腈;梯度洗脱条件:0～25min,5%B～100%B;流速0.4 mL/min;进样量3 μ L。

1.2.2 HPLC条件

Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);柱温35 ℃;流动相A为0.05 mol/L 醋酸铵-醋酸缓冲液(pH 6.5),B为乙腈。梯度洗脱条件:0～15 min,3%B～13%B; 15～22 min,13%B～17%B; 22～25 min,17%B～23%B; 25～35 min,23%B～25%B; 35～45 min,25%B～30%B;流速1.0 mL/min;检测波长254 nm。进样量3 μ L。

1.2.3 质谱条件

参考文献[8]并经过优化确定的条件为:电喷雾正离子模式(ESI+);扫描范围m/z 100～1500;喷雾电压(IS)4500 V;去簇电压(DP)70 V;碰撞能量(CE)25 V;辅助加热温度550 ℃;雾化气压强379 kPa;辅助加热气压强379 kPa;气帘气压强241 kPa。实验数据采用PeakView 1.2软件处理,每3 h对质谱进行校正,以保证质量误差在规定范围内。

1.3 溶液的制备
1.3.1 混合对照品溶液

15种氨基酸各取适量,精密称定,加0.1 mol/L 盐酸溶液,配成1 g/L对照品储备液,备用。

1.3.2 供试品溶液

取天南星药材粉末约0.2 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入0.1 mol/L 盐酸25 mL,称重,超声提取40 min,取出,冷却后用0.1 mol/L 盐酸补足重量,摇匀,滤过,取滤液即得。

1.4 衍生化方法

精密量取供试品溶液200 μ L,置于1.5 mL塑料管中,精密加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液50 μ L、1 mol/L 三乙胺-乙腈溶液50 μ L,涡旋混匀1 min,25 ℃下水浴1 h后精密加入正己烷1 mL,涡旋混匀1 min,放置10 min,取下层溶液于 13000 r/min 高速离心10 min,取上清液[9, 10]。

2 结果与讨论
2.1 UHPLC-MS/MS定性
2.1.1 分析条件的优化

UHPLC的流动相采用乙腈-水时,各色谱峰有不同程度的展宽及分叉现象,加入甲酸能明显改善峰形,经优化确定采用乙腈-0.01%(v/v)甲酸水溶液作为流动相,20 min内线性梯度洗脱,可实现天南星中氨基类成分的分离。

比较电离方式,发现在正离子模式下能检测到20种氨基类化合物,并且各化合物的二级碎片较负离子模式下更便于结构解析。因此,选择正离子扫描方式进行检测,可以较全面地反映天南星中氨基类成分的化学信息。

优化碰撞能量,在正离子模式下分别采用20、25、30、35 V,结果显示当碰撞能量升高时产生的碎片增多,但碎片离子峰的灵敏度降低;当碰撞能量过低时则碎片信息减少。为兼顾灵敏度和碎片信息,本实验选择25 V作为碰撞能量,在该条件下主要被分析物的分子离子均有一定的丰度且较稳定,碎片离子信息也较丰富。

2.1.2 氨基类化合物-PITC衍生物的特征

氨基类化合物-PITC衍生物都具有离子碎片(C7H6NS+,m/z 136),以其作为特征离子可易于进行该类化合物的质谱解析。图1为氨基类化合物与PITC的反应方程式。

图 1 氨基类化合物与异硫氰酸苯酯的衍生化反应 Fig.1 Derivatization reaction of amino compounds with PITC
2.1.3 定性结果

采用LC-MS/MS分析天南星提取物的PITC衍生化产物,解析分析结果。首先,运用未知化合物筛查软件(IDA)检索含有m/z 136碎片离子的化合物,结果见图2;然后,提取上述含m/z 136碎片离子化合物的二级质谱图及选择离子色谱图,利用飞行时间质谱能够得到精确质量数的特点,根据各化合物的质荷比,利用PeakView检索元素组成,采用测得的离子质量数与计算质量数相对误差较小的原则,结合考虑氨基类成分-PITC衍生物的特征,可以得到各化合物化学式;第三,利用PeakView-[XICManager]软件对推测得到的化合物进行匹配;第四,进一步分析二级碎片,推测化合物的结构;第五,运用对照品确证鉴定结果。以表2中4号与11号为例:经IDA检索得到其m/z分别为 241.0643、317.0960,其化学式分别为C10H12N2SO3、C16H16N2SO3,选择离子色谱图及二级质谱碎片图如图3所示;进一步分析二级碎片,发现分别具有易中性丢失H2O、CO碎片,应为含有羧基的氨基类成分,推测为丝氨酸和酪氨酸的PITC衍生物。氨基酸-PITC衍生物相关裂解方式如图4所示;依此解析,扣除阴性对照与试剂空白,推测了18个氨基酸、2个胺类化合物,结果见表2(化学式均为衍生物的[M+H]+),并用对照品对其中16个氨基酸进行了验证。与文献报道[7, 8]相比,本文建立的方法,将中药材提取物经PITC柱前衍生化,通过对衍生化产物裂解规律的探讨,以引入的衍生化试剂C7H6NS+(m/z 136)作为特征离子,进行系统性筛查,可使分析过程更加快速准确,简便。

图 2 天南星提取物-PITC衍生物二级质谱碎片m/z 136的选择离子色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatogram of m/z 136 from MS/MS in the extract of Rhizoma Arisaematis derivatized with PITC

表 2 天南星提取物-PITC衍生物的UHPLC-MS/MS解析结果 Table 2 Identification results of extracts of Rhizoma Arisaematis after derivatization with PITC by UHPLC-MS/MS

图 3 表2中(a)4号和(b)11号的选择离子色谱图及二级质谱碎片图 Fig.3 Extracted ion chromatograms and MS/MS spectra of (a) No. 4 and (b) No. 11 in Table 2

图 4 氨基酸-PITC衍生物质谱裂解方式 Fig.4 Illustration of pyrolysis ways of amino acid-PITC derivatives

2.2 HPLC定量
2.2.1 HPLC条件的优化

由于氨基酸为两性物质,缓冲液pH会影响到不同氨基酸的离解程度,从而影响氨基酸的保留值,故对溶液pH进行了考察。根据文献[11, 12]和色谱条件优化的结果,本文选用醋酸铵-醋酸(pH 6.5)梯度洗脱的方法,可使15种氨基酸很好地分离。

2.2.2 衍生化条件的优化

PITC与氨基类成分反应产率随衍生化试剂用量、三乙胺用量、反应时间和温度的不同而有明显的差异[13]。优化结果显示当PITC、三乙胺均为50 μ L、反应温度为25 ℃、反应时间为60 min时各氨基酸衍生化后色谱峰面积趋于稳定(见图5)。

图 5 衍生反应条件的优化 Optimization of derivatization conditions
a. PITC dosage; b. triethylamine dosage; c. reaction temperature; d. reaction time.

2.2.3 专属性试验

取衍生化后的混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液,按所建立的色谱条件进行测定,15种氨基酸色谱峰分离度均大于1.5,理论塔板数均大于 5000,空白溶液无干扰(见图6)。图6中14号峰为苯丙氨酸,15号峰为试剂空白的色谱峰,由于在现有色谱条件下没能达到基线分离,故放弃了苯丙氨酸的定量。天冬酰胺、蛋氨酸含量过低,也未定量。

图 6 (a)对照品溶液、(b)供试品溶液及(c)空白溶液的高效液相色谱图 Fig.6 HPLC chromatograms of(a)reference substance solution,(b)sample solution and(c)blank solution Peaks: 1. Asp; 2. Glu; 3. Ser; 4. Gly; 5. His; 6. Arg; 7. Thr; 8. Ala; 9. Pro; 10. Tyr; 11. Val; 12. Ile; 13. Leu; 14. Phe; 15. unknown; 16. Try; 17. Lys.
2.2.4 线性方程及检出限

以氨基酸溶液的质量浓度X(mg/L)为横坐标,峰面积Y(V\5s)为纵坐标,得到15个氨基酸的回归方程。谷氨酸、色氨酸在2～100 mg/L、精氨酸在6～300 mg/L、其余各氨基酸在0.8～40 mg/L 范围内均呈良好的线性关系(r=0.9995～0.9999)。将最低浓度混合对照品溶液逐步稀释,进样分析,以S/N=3确定检出限(LOD),结果见表3。

表 3 线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限 Table 3 Regression equations,correlation coefficients (r),linear ranges and limits of detection (LODs)

2.2.5 精密度、重复性、稳定性、回收率试验

按 2010 版《中国药典》附录HPLC法指导原则考察精密度和重复性,RSD均小于3% ;供试品溶液在18 h内基本稳定;15种氨基酸平均回收率在95%～105%之间,RSD均小于3% 。结果表明符合含量测定方法学要求。

2.2.6 样品测定

天南星药材12批(见表1),每批平行3份,制备供试品溶液并衍生化,以建立的HPLC方法测定含量,RSD均小于3% ,符合 2010 版《中国药典》含量测定要求;12批药材中15种氨基酸含量的RSD在32% ～118%之间,表明各批次药材间氨基酸含量差异较大,该差异性原因有待进一步研究(见表4)。

表 4 12批中药材天南星的游离氨基酸含量(n=3) Table 4 Content of free amino acids in 12 batches of Rhizoma Arisaematis samples (n=3)    mg/g
3 结论

本文应用PITC作为衍生化试剂进行柱前衍生化,使天南星药材中的氨基酸及氨基类成分在C18色谱柱上实现了分离,并为UHPLC-MS/MS解析提供了特征离子碎片,为HPLC分析实现了紫外检测。实验结果显示,方法简单、灵敏、准确,具有良好的重复性和稳定性,为中药中相应成分的分析提供了思路。

但本文未能检测到药材中小肽类成分,同时对同分异构体的检测仍存在缺陷,如经衍生化后的亮氨酸、异亮氨酸,其选择离子色谱图与二级碎片都未能实现分辨。因此将继续开发新的化学试剂和新方法,以简化衍生化步骤,加快衍生反应速度和选择性,提高试剂及衍生产物的稳定性,使之容易色谱分离,以便实现极性非紫外活性成分的分析。

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