农产品中的农药残留已成为当前公认的农业和环境问题,快速、准确地对农药残留进行测定,是农药监管的重要技术保障。但农药种类繁多,包括有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯等,其物理化学性质各异,传统的气相色谱结合选择性检测器如火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)和氮磷检测器(NPD)在分析效率上已不能满足农药多残留的需要,而气相色谱-质谱联用法(GC-MS)因兼具定性、定量和多类多残留同时监测等能力,已逐渐成为一种不可或缺的技术手段[1, 2, 3]。
在GC-MS分析中,为提高方法的灵敏度和选择性,人们通常采用选择离子监测(SIM)模式进行检测[4, 5],但由此会造成目标物质谱信息的大量丢失,假阳性结果的风险随之提高;其次,因受到色谱分离能力及质谱扫描速度的限制,多组分分析须根据色谱峰的重叠程度进行分组,并分数次进样,使得分析通量明显降低[1, 6]。理论上,全扫描(full scan)模式对于单次进样中可检测的农药数量是不受限制的,且可提供待测物的全质谱图,因而在分析效率和定性能力方面较SIM模式显著提高。但长期以来,全扫描模式主要因分析灵敏度低及共流出杂质导致谱图选择性变差等问题,阻碍了对其推广使用。美国国家标准技术研究院(NIST)开发的自动质谱解卷积鉴定系统(automated mass spectral deconvolution and identification system,AMDIS)通过化学计量学的方法对共流出物的全扫描质谱图进行拆分处理,起到“提纯”目标物质谱图的作用,在提高全扫描模式的选择性及定性结果的准确性上表现出强大的功能[7, 8, 9],因此被广泛用于农残分析、未知物鉴定、药物筛查及其代谢分析等研究领域[10, 11, 12]。此外,利用程序升温进样(programmable temperature vaporizer,PTV)技术结合溶剂排空模式,可实现超过50 μ L以上的大体积进样[13],不仅能弥补全扫描模式下灵敏度低的缺陷,还可降低方法的基质效应[14, 15]。然而,目前有关这两种技术同时应用于GC-MS分析中的研究还较少。
本文将程序升温大体积进样和解卷积两项技术结合,运用到蔬菜、水果中多农药残留检测中。选择了我国蔬菜、水果例行监测和主要贸易国检测频率较高的32种典型农药,研究了程序升温进样条件对方法灵敏度等的影响,考察了在共流出杂质干扰严重时解卷积技术对单个化合物的识别能力。该研究结果解决了在全扫描模式下选择性差和灵敏度低的两大技术瓶颈,使得对数十种农药的一次进样、同时检测及快速的数据处理成为可能。
GC6890N气相色谱仪,配5973质谱检测器和程序升温大体积进样口(美国Agilent公司);高速分散机(德国IKA公司); AMDIS(version 2.62,美国NIST2005. L附带软件)。
乙腈、丙酮、甲苯(农残级,美国TEDIA公司);乙腈-甲苯溶液:乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v);无水硫酸镁(纯度＞97% ,比利时ACROS公司);氯化钠(农残级,德国CNW公司);石墨碳黑和丙氨基固相萃取柱(500 mg×6 mL,美国Supelco公司);同位素内标(D10-毒死蜱)及32种农药标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。内标溶液的配制:取适量D10-毒死蜱标准品,用丙酮配成100 mg/L 的储备液,再用丙酮稀释成5 mg/L 的内标使用溶液。农药标准溶液的配制:取各农药标准品适量,用丙酮配成100 mg/L 的单标准储备液,再根据其在质谱中的响应,用丙酮配制成所需的混合标准工作液,其间加入一定量的内标使用溶液。以上农药标准溶液及内标溶液均于-18 ℃以下贮存。
参照QuEChERS方法[16]并进行部分改良,即称取25.0 g粉碎均匀的试样于250 mL离心管中,加入25.0 mL乙腈,在高速分散机中高速匀浆2 min,加入1 g氯化钠和10 g无水硫酸镁,于高速分散机中(8 000 r/min)匀浆1 min,在 4 000 r/min 下离心3 min,使乙腈和水相分层。取上清液10 mL至50 mL鸡心瓶中,在旋转蒸发仪上于50 ℃以下减压浓缩,当浓缩至约1 mL时,加入10 mL乙腈,使提取液中少量水分与乙腈形成共沸物除去,最后使试液体积约为1 mL,待净化。
参照GB/T 19648-2006[17],并做了部分改进。将石墨碳黑和丙氨基固相萃取柱上下串联,先用5 mL乙腈-甲苯溶液预淋洗,当溶剂液面到达柱吸附层表面时,立即加入待净化的浓缩试液,流出液开始收集,再每次用3 mL乙腈-甲苯溶液洗涤鸡心瓶3次,并将洗涤液移入柱中,用25 mL乙腈-甲苯溶液洗脱农药,合并洗脱液于鸡心瓶中,并在旋转蒸发仪上于50 ℃以下减压浓缩近干。用丙酮定量转移并定容至2.5 mL,其间加入125 μ L 5 mg/L 的内标溶液,混匀,待测。
色谱条件 色谱柱:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);柱温箱升温程序:初始温度70 ℃,保持5 min;以25 ℃/min 升温至150 ℃,再以3 ℃/min 升温至200 ℃;最后以8 ℃/min 升温至280 ℃,保持10 min。PTV进样方式:溶剂排空模式。PTV进样程序:初始温度5 ℃,保持2.5 min;以500 ℃/min 升温至280 ℃,保持2 min;再以720 ℃/min 升温至450 ℃,保持5 min。溶剂排空流量:50.0 mL/min;吹扫时间:2 min。溶剂排空压力:0 kPa;进样口压力:138 kPa(恒压模式);进样量:20 μ L;冷却气:液体CO2;载气:氦气,纯度≥99.999% 。
质谱条件 电子轰击源70 eV,离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃; GC-MS接口温度280 ℃;数据采集模式为全扫描,m/z 35～550。32种农药的总离子流图见图1。
将一定浓度的单一农药标准溶液注入GC-MS中,得到各农药的保留时间和质谱图,利用AMDIS建立目标化合物谱库,对于AMDIS数据处理软件,其关键参数设置为:最小峰宽2 s,最小峰面积500,保留时间窗口6 s。
若样品中未知组分的色谱保留时间与标准品一致,且相应的质谱图经解卷积后与标准质谱图一致,则可判定为该农药。采用内标法最高丰度离子定量,选择解卷积后质谱图中基峰的峰面积与标准品相比进行定量。
程序升温大体积进样时,PTV初始温度、升温速率、溶剂排空流量及吹扫时间对方法的灵敏度、重现性有较大影响。因此,本文从32种农药中选取了6种典型农药(包括不同类型的低沸点和高沸点组分),研究了上述因素对其响应的影响,并对这些参数进行了优化。
本文选取丙酮和干冰分别作为进样和冷却介质,研究了PTV初始温度分别为5、10、20和40 ℃时对6种农药(甲胺磷、敌敌畏、氧乐果、毒死蜱、甲氰菊酯和溴氰菊酯)响应的影响。结果表明,随着PTV初始温度的升高,6种农药的峰高总体呈下降趋势,尤其是敌敌畏、甲胺磷等挥发性农药的下降程度更为明显,如敌敌畏40 ℃时的峰高比5 ℃损失了近80% ,甲胺磷和氧乐果分别损失近70%和50% 。而温度的变化对高沸点化合物如毒死蜱、溴氰菊酯等的影响则相对较小。因此,综合考虑灵敏度和冷媒消耗量因素,本文选择5 ℃作为PTV的初始温度。
图2显示了不同PTV升温速率(100、200、500、720 ℃/min)对6种农药峰高的影响。可以看出,随着升温速率的提高,不同农药的峰高变化情况各异,但以500 ℃/min 时多数农药的灵敏度达到最高。其中,甲胺磷、氧乐果、毒死蜱受升温速率的影响最大,如与100 ℃/min 的升温速率相比,500 ℃/min 时甲胺磷的灵敏度提高约2.5倍,氧乐果和毒死蜱分别提高近1.7倍和3倍。虽然溴氰菊酯在720 ℃/min 时灵敏度最好,但考虑到多数农药,本文选择500 ℃/min 为最佳PTV升温速率。
衬管中残存适量溶剂会起到保留挥发性组分的作用。试验表明,当溶剂排空流量(vent flow)和吹扫时间(purge time)设置过低(如分别小于50 mL/min 和2 min),过多的残留溶剂将导致部分农药(尤其是出峰较早的化合物)出现严重裂解;反之,若吹扫过干,部分农药则被吹走,最终导致其响应值下降。为此,在上述最佳的PTV初始温度和升温速率条件下,本文还考察了溶剂排空流量和吹扫时间对6种农药灵敏度的影响(见图3)。其中图3a表明了溶剂排空流量为50、125、150和200 mL/min 时对上述农药相对峰高的影响。可以看出,随着溶剂排空流量增大所有农药的峰高均呈下降趋势,特别是敌敌畏等低沸点农药的下降最为明显,与50 mL/min 相比,当流量提高至200 mL/min 时其峰高几乎下降了一半,而对于沸点较高的农药,其峰高的下降范围仅在10% ～30%之间,且沸点越高下降越不明显。
图3b则表明了不同吹扫时间(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min)对6种农药相对峰高的影响,随着时间的增加,所有农药的峰高均有所下降,且与排空流量的研究结果类似,仍然是挥发性强的农药下降幅度较大。然而,与溶剂排空流量相比,吹扫时间的增加对峰高的影响相对较小,即与2.0 min相比,4.0 min的吹扫时间使得6种农药的灵敏度下降范围在5% ～37%之间。上述结果表明,溶剂排空流量和吹扫时间分别设为50 mL/min 和2.0 min时较理想。
为考察方法对实际样品基质的分辨能力,实验在黄瓜、四季豆、菠菜、茄子、大白菜、青菜和西红柿7种样品基质中,进行0.1 mg/kg 水平的加标实验,按本方法进行测定。结果表明,当样品质谱图经解卷积处理后,各农药谱图与谱库质谱图的匹配度均＞70,即满足可靠的定性标准[18]。此外,本文还考察了解卷积技术运用于实际阳性样品的效果,如图4a为荷仁豆样品中含0.077 mg/kg 甲胺磷的总离子流图,可以看出,基质对甲胺磷(保留时间tR为8.167 min)的干扰非常严重,在总离子流图中很难将其识别;即便是采用提取质谱图(如图4b所示),甲胺磷的几个特征离子(m/z 94、95、141)也基本被背景掩盖,难以进行谱库检索和结果判定;但经解卷积后,可获得与谱库质谱图匹配度极高(匹配度91)的质谱图(见图4c),并实现准确定性、定量。图5是小松菜中检出p,p′-滴滴伊的结果图,尽管它的检出量很低(0.030 mg/kg),且基质干扰更为严重,但用解卷积技术后仍获得可靠的定性结果(匹配度83)。由此可见,采用解卷积技术可明显提高全扫描方法的选择性。
尽管大体积进样能显著提高方法的灵敏度,但过大的进样量会加剧对衬管及色谱系统的污染,进而降低方法的耐受性。为此,本文考察了不同进样体积(10、20、30、40 μ L)对方法耐受性的影响。结果表明,随着进样量的增加,各农药的峰面积虽不断增大,但当进样体积大于30 μ L时,甲胺磷等色谱峰形会急剧变宽,以致影响对其准确定量。因此,本文确定方法的进样量为20 μ L;在此条件下,实验通过对基质加标样品连续45次进样,考察了甲胺磷、氧乐果等敏感农药的峰形变化情况。图6是第1、15、30和45次进样的分析结果,可以看出,甲胺磷、氧乐果一直保持良好的峰形;毒死蜱、溴氰菊酯一般不易受色谱系统污染程度的影响,同样在本系统中获得良好的稳定性。除了考察进样次数对农药峰形的影响外,实验还研究了连续45次进样中甲胺磷、氧乐果、毒死蜱和溴氰菊酯的峰高变化情况。结果表明,随着进样次数的增加,甲胺磷、氧乐果灵敏度略有下降,但误差仍在10%以内,而毒死蜱和溴氰菊酯的峰高基本稳定。以上研究表明,当进样量为20 μ L时,本方法具有较好的耐受性,可用于实验室的常规检测。
将混合农药标准储备液配制成6个质量浓度系列的标准工作液(其中内标的质量浓度均为0.25 mg/L),分别按已建立的GC-MS方法进行测定。以定量离子的峰面积与内标峰面积的比值对质量浓度绘制标准曲线,各农药的方法检出限(LOD)采用基质加标实验确定,即在对空白基质中添加低浓度(与预期LOD相当)的目标物标准品,按建立的方法进行样品前处理及测定,以每种农药信噪比(S/N)≥3,同时满足与谱库中质谱图匹配度＞70时的添加浓度确定为LOD,32种农药的特征离子、保留时间、线性范围、回归方程、相关系数(r)和LOD见表1。可以看出,在一定浓度范围内,各农药的线性关系较好,对应的相关系数均大于0.995。方法的LOD为2.0～5.0 μ g/kg,满足国内外残留限量检测的要求。
本文选取菠菜、四季豆和黄瓜作为代表性样品,每种空白样品采用3个添加水平进行回收率实验(n=6),并计算平均回收率和相对标准偏差(RSD),实验结果见表2。可以看出,在低、中、高3个加标水平下,32种农药在3种基质中的平均回收率为65.2% ～120.3% ,RSD为4.1% ～22.3% ,符合欧盟SANCO/12571/2013[19]的指令要求。
在农贸市场随机选取50余份蔬菜、水果样品,按本文建立的方法进行处理及测定。结果表明,有5份样品中分别有甲胺磷、氧化乐果、毒死蜱和甲氰菊酯等农药检出,对应的检出浓度在0.020～0.66 mg/kg 之间,其中大白菜中同时有三氟氯氰菊酯和氯氰菊酯两种农药检出,含量分别为0.088和0.66 mg/kg。此外,从以上检出农药的定性结果看,采用AMDIS技术,各检出农药与谱库中质谱图的匹配率均≥79,说明本文建立的程序升温进样GC-MS农药残留检测方法具有灵敏度高,分析结果准确、可靠等特点,可用于实际样品中上述32种农药的高通量定性、定量分析。
本研究采用程序升温大体积进样和质谱解卷积技术,建立了蔬菜、水果中32种典型农药的GC-MS检测方法,系统优化了PTV进样参数和进样体积,并考察了方法耐用性。通过基质加标、实际样品测定等实验,结果表明,本方法灵敏度高、选择性好,适用于蔬菜、水果中上述农药的分析要求。
2014, Vol. 32 Issue (12): 1390-1399
PDF (1622 KB)
2014, Vol. 32 Issue (12): 1390-1399
PDF (1622 KB)