壳寡糖和酪氨酸酶(酶活力大于 1 000 u/mg,等电点5.92)都购自美国西格玛公司,甲醇(色谱纯)购自德国默克公司,苯酚和其他所有试剂都购自天津科密欧公司。整个实验过程中采用的水均为Milli-Q水(18 M Ω \5cm)。如果没有特殊说明,电化学实验过程中的电解质溶液均采用50 mmol/L 的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。

透射电镜(TEM,JEM-2000EX,日本);高效液相色谱仪(安捷伦1200,配二极管阵列检测器，美国);物理吸附仪(康塔SI4,美国); CHI 440B电化学工作站(上海辰华公司);三电极体系:玻碳电极(GC)为工作电极,Ag/AgCl为参比电极(KCl浓度3 mol/L),铂电极为对电极;超声波清洗器。

本研究以采用溶胶-凝胶法制备的直径为10 nm的单分散硅球作为硬模板,然后以苯乙烯为碳源,经惰性气氛下的高温催化碳化-去除模板等步骤后,获得10 nm孔径的有序介孔碳。介孔碳材料合成的具体步骤:首先,在100 mL的三颈烧瓶中加入 0.029 2 g L-赖氨酸、27.8 mL去离子水以及4 mL的正硅酸乙酯,在70 ℃下磁力搅拌反应12 h,于80 ℃缓慢蒸干溶剂，得到直径为10 nm的纳米硅球。在石英研钵中研细上述硅球,然后向模板硅球中加入Ni(NO₃)₂·6H₂O的乙醇水溶液(乙醇/水的体积比为1:1),最终使Ni与Si的物质的量比为1:34。然后将浸渍过Ni(NO₃)₂·6H₂O的SiO₂模板在80 ℃烘箱中干燥，然后在红外压片机上压成厚1 mm的薄片(压力6 MPa)。向10 mL新鲜蒸馏的苯乙烯单体中滴加0.05 mL浓硫酸,使苯乙烯初步聚合;取1 g浸渍Ni(NO₃)₂的SiO₂模板置于25
mL坩埚中,加入5 mL初步聚合的苯乙烯,于160 ℃预碳化24 h,然后将SiO₂/C的复合物移入管式炉中,在高纯氮气保护下升温至850 ℃热解3 h,升温速率为5 ℃/min。热解结束后将复合物冷却至室温,在20%氢氟酸溶液中搅拌12 h去除SiO₂,过滤、洗涤后干燥,得到孔径为10 nm的介孔碳材料^[20]。将制备得到的纳米硅球(模板)和介孔碳材料进行透射电镜表征。采用物理吸附仪表征介孔碳材料的氮气吸附-脱附等温曲线和孔径分布。测定之前,需要将介孔碳样品于180 ℃脱气6 h。

首先将玻碳电极分别在含粒径1、0.3、0.05 μ m氧化铝微球的麂皮上打磨,然后用去离子水和无水乙醇分别超声清洗5 min以去除电极表面弱吸附的氧化铝,用氮气将电极表面吹干。经过条件优化,选择的介孔碳、酪氨酸酶以及壳寡糖的质量浓度分别为0.2、2.5、1.5 g/L。基于介孔碳材料的电化学酪氨酸酶生物传感器的具体组装步骤:首先,将10 μ L 10 g/L 的酪氨酸酶溶液加入到20 μ L 0.4 g/L 介孔碳溶液中振荡摇匀30 min;随后,将具有极强成膜能力的壳寡糖溶液(10 μ L 6 g/L)加入到上述溶液中,得到酪氨酸酶与介孔碳的混合溶液;最后,取4 μ L上述溶液滴加到洁净的玻碳电极表面,用烧杯将玻碳电极盖住,使玻碳电极表面的水分缓慢蒸干形成均一的薄膜。电极表面的水分蒸干后得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极。电化学测定之前,所有修饰电极均需要在50 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中搅拌30 min以去除电极表面弱吸附的成分。

取5个具有代表性的水样各1 L,分别用25、15、10 mL的苯萃取3次,合并3次萃取有机相,随后采用0.45 μ m微孔滤膜过滤,得到待测溶液。然后分别采用电化学酪氨酸酶生物传感器和高效液相色谱法进行苯酚检测。

电化学酪氨酸酶生物传感器采用恒电位方法进行苯酚检测(控制电位为-0.1 V,基底溶液为8 mL 50 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液)。

高效液相色谱法测定条件：Diamonsil C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m)为分析柱;流动相为甲醇-水(4:1,v/v)，流速1 mL/min；检测波长为272 nm；柱温为30 ℃;进样量为10 μ L。

电化学酪氨酸酶生物传感器检测结果准确性(A)的评价公式:A=(C_H-C_E)/C_H×100% ,其中C_H代表高效液相色谱法检测的浓度值;C_E代表电化学酪氨酸酶生物传感器检测的浓度值。

通过透射电镜对按1.3节所述方法制备的纳米硅球进行了表征。从图1a中可以看出,这些硅球粒径均一(10 nm左右),呈单分散性。将这些纳米硅球采用红外压片机压成片状作为制备介孔碳的硬模板。以上述合成的硅球为模板合成的介孔碳的透射电镜图见图1b,可见合成的介孔碳孔径均一,排列规则有序,呈蜂窝状。

图1

Fig. 1

图1 (a)10 nm直径纳米硅球和(b)介孔碳材料的透射电镜图 Fig.1 Transmission electron microscopy images of (a) 10 nm silicon spheres and (b) graphitized mesoporous carbon (GMC)

图2给出了10 nm孔径介孔碳材料的氮气吸附-脱附等温线及相应的孔径分布曲线。从图2a可以看出,介孔碳材料的吸附等温线由于毛细管浓缩现象呈现较大的滞后回路,是典型的介孔结构特征曲线,进一步说明制备的介孔碳材料具有典型的介孔结构。从图2b的孔径分布曲线可以看出,10 nm孔径介孔碳的孔径分布较窄,主要集中在8～12 nm,其比表面积为 1 060 m²/g,孔体积为3.467 cm³/g,介孔碳材料大的比表面积和孔体积为固载和容纳酶分子提供一个有利的微环境,与酪氨酸酶三维尺寸(6.5 nm×9.8 nm×5.5 nm)相近的孔径能够发挥介孔碳材料的“空间限制效应”,防止酶分子去折叠失活,保持酶分子的体外稳定性。

图2

Fig. 2

图2 介孔碳材料(10 nm)的(a)氮气吸附-脱附等温线及(b)孔径分布曲线 Fig.2 (a) Nitrogen adsorption-desorption isotherms of GMC (10 nm) and (b) the pore size distribution of GMC

图3

Fig. 3

图3 基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器的构建过程及检测目标物苯酚的原理示意图 Fig.3 Schematic diagram of the fabrication process of electrochemical tyrosinase biosensor based on ordered graphitized mesoporous carbon and the phenol detection mechanism

电化学酪氨酸酶生物传感器的构建过程如图3所示:介孔碳材料(10 nm)通过液相自组装将酪氨酸酶诱陷到介孔碳介孔中形成超分子组装体,然后将其固载到电极表面构建酶传感器。酪氨酸酶是一种铜蛋白,能够利用分子氧催化苯酚生成相应的邻苯酚和邻苯醌,而邻苯醌又可以在电极表面通过电化学催化还原生成邻苯酚形成信号循环放大。

图4

Fig. 4

图4 (a)不同扫描速度下基于介孔碳材料的电化学酪氨酸酶 生物传感器在除氧磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中的循环伏安图(扫描速度从内到外依次为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mV/s)和(b)循环伏安阴极、阳极峰电流与扫描速度的关系曲线 Fig.4 (a) Cyclic voltammograms of tyrosinase based on mesoporous carbon(pore size,10 nm) immobilization on glassy carbon electrode (Tyr-GMC10-Chi/GC) in deoxygenized PBS (pH 7.0) at scan rates from inner to outer of 10,20,30,40,50,60,70,80,90,100 mV/s and (b) plots of cathodic and anodic peak currents versus scan rates

图4是基于介孔碳材料的电化学酪氨酸酶生物传感器在除氧磷酸盐缓冲溶液中循环伏安图(扫描速度从10 mV/s到100 mV/s)。随着扫描速度的增加,酪氨酸酶电极的阴极和阳极峰电流同时增加,同时其峰峰电位差也随之增加。从图4b中可以看出,其阴极和阳极峰电流随着扫描速度的增加(10～100 mV/s)线性增加,说明酪氨酸酶和玻碳电极之间的电子传输能够很容易地在复合膜修饰电极上实现,酪氨酸酶和玻碳电极之间的电子传输是一个表面控制的电化学过程。

图5

Fig. 5

图5 不同传感器检测苯酚的(a)典型电流-时间响应曲线及(b)浓度-电流曲线 Fig.5 (a) Typical current-time response curves and (b) corresponding calibration curves of concentration versus current for phenol detection by different electrochemical biosensors a. upon successive additions of 8 μ L 1 mmol/L phenol into 8 mL 50 mmol/L PBS (pH 7.0). Applied potential: -0.1 V versus Ag/AgCl.

图5给出了不同传感器检测苯酚的电流-时间响应曲线。从图5可以看出,基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器(Tyr-GMC10-Chi/GC)的性能高于基于电化学酪氨酸酶生物传感器(Tyr-Chi/GC)。通过对照可以看出,电化学酪氨酸酶生物传感器检测苯酚时的信号强度小,信号的噪声也较小,信号更稳定。由于介孔碳的比表面积很大,活性位点很多,苯酚在电极表面电催化生成的中间过渡态醌类等沉积在介孔碳表面,导致生物传感器的电信号产生较大的噪声。经过21 d的存储后,基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器能保持85%的最初响应信号,说明酪氨酸酶在介孔碳材料“空间限制效应”作用下有较好的体外长期稳定性。基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器对苯酚在0.1～10 μ mol/L 范围内线性相关,检出限为20 nmol/L (1.88 μ g/L),灵敏度为 1 385 mA/(cm² · mol);而无介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器对苯酚的检出限为100 nmol/L,灵敏度为154.9 mA/(cm² · mol)。 结果显示基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器的灵敏度远远高于无介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器的灵敏度(8.9倍);其检出限(1.88 μ g/L)低于中国国家饮用水标准(GB 5749-2006中苯酚限量为低于2 μ g/L)。由于酪氨酸酶分子对苯酚的专一性生物催化作用,电化学酪氨酸酶生物传感器检测苯酚具有良好的选择性。这说明本生物传感器可以作为快速检测水体中苯酚的有用工具,可实现苯酚的高灵敏检测。

应用基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器对5个水样品中的苯酚进行检测，并采用HPLC方法对其检测结果的准确性进行了验证。基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器的检测结果为2个样品未检出苯酚，另外3个样品中苯酚的质量浓度分别为0.7、0.42、0.23 mg/L 。HPLC的检测结果也是有2个样品未检出苯酚，另外3个样品中苯酚的质量浓度分别是0.62、0.53、0.19 mg/L。可见该生物传感器与HPLC的检测结果基本一致。采用准确性评价公式对检测结果的准确性进行评价,结果分别为-13.0% 、20.8%和-21.1% 。两种方法结果对比表明,基于介孔碳的电化学生物传感器方法检测苯酚浓度与HPLC方法基本一致,表明该生物传感器方法相对准确和可靠,可以作为苯酚污染物的突发污染事件的现场应急检测的备选方法。