目前人们使用的染发剂依据染发效果可分为3类:暂时性、半永久性和永久性[1]。永久性染发剂又可以分为植物永久性、金属永久性和氧化永久性;前两者的染料分别提取于植物和矿物质,植物性染发剂价格贵[2],国内少用,而金属性染发剂对人体伤害极大[3],现已几乎不用。氧化永久性染发剂是目前市场上最流行的一类染发剂[4],含有染料中间体和偶合剂,这些染料中间体和偶合剂渗透进入头发的皮质后,发生氧化反应、偶合和缩合反应形成较大的染料分子,被封闭在头发纤维内,所以难以从头发纤维孔径中洗脱出来。染料中间体多是苯胺类等成分,特别是对苯二胺及其衍生物等有毒物质,染发时就易通过发髓、皮肤或呼吸等多种方式被人体吸收,其一旦进入人体内便很难排出,容易蓄积中毒,而且具有诱导基因突变致癌作用和极易引发皮肤过敏反应[5]。
基于染发剂的安全问题,各国都出台了相关法规(如欧盟化妆品法规(EC) No 1223/2009,美国FDA的联邦法例第21章以及加拿大的食品和药物法令中的化妆品条例等)限制其有害物质的含量,并推荐了相关有害物质的检测方法。我国《化妆品卫生规范》(2007年版)[6]中规定了93种暂时允许使用的染料成分,且对其最大允许使用浓度、其他限制和要求等做了严格的规定,但现有的国家标准法规对允许使用染料成分的检测覆盖率还不及60% ,远不能满足染发剂分析的需要。目前报道的染发剂中染料的检测技术有很多,主要包括高效液相色谱法[7, 8]、液相色谱-质谱联用法[9]、气相色谱法[10]、气相色谱-质谱联用法[11, 12]、离子色谱法[13]和毛细管电泳法[14]。由于本文研究的6种染料物质极性强、不易挥发、不稳定等性质,相比气相色谱或气相色谱-质谱联用法,高效液相色谱和液相色谱-质谱联用法更适合用于检测,目前应用最多的是液相色谱-质谱联用法[15, 16, 17]。本文建立了同时测定染发剂中6种染料的超高效液相色谱-串联质谱方法,采用电喷雾离子(ESI)源,在正离子和多反应监测(MRM)模式下进行定性定量分析。该方法前处理简单,易于操作,灵敏度高,可有效满足对4,4′-二氨基二苯胺硫酸盐和2,4-二氨基苯酚硫酸盐等6种染发剂染料进行快速检测工作的需要。
超高效液相色谱仪Waters ACQUITY UPLC系统配Quattro Premier XE串联四极杆质谱仪(美国沃特世公司); Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司);涡旋混合器(江苏健康医药公司);高速冷冻离心机(美国贝克曼公司,Avanti J-E);超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司);分析天平(赛多力斯(北京)科学有限公司,感量为0.1 mg)。
6种标准品:4,5-二氨基-1-(2-羟乙基)吡唑硫酸盐(4,5-diamino-1-(2-hydroxyethyl) pyrazole sulfate,DHPS),2-(2-羟基)乙基对苯二胺硫酸盐(2-(2-hydroxy) ethyl-p-phenylene diamino sulfate,HEPS),4,4′-二氨基二苯胺硫酸盐(4,4′-diaminodiphenylamine sulfate hydrate,DSH),羟乙基-3,4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐(N-(2-hydroxyethyl)-3,4-methylenedioxyaniline hydrochloride,HMH),2-氯-p-苯二胺硫酸盐(2-chloro-p-phenylenediamine sulfate,CPS)及2,4-二氨基苯酚硫酸盐(2,4-diaminophenol sulfate,DPS),纯度均≥95.0% ,购自上海安谱公司。乙酸铵(优级纯,上海生工生物工程有限公司);乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司);水为Milli-Q超纯水。空白基质溶液为不含6种目标分析物的染发膏样品提取液。
准确称取适量上述标准品,分别置于25 mL棕色容量瓶中,用水溶解,配制质量浓度约为500 mg/L 的单标准储备液。用移液器移取各单标储备液适量至50 mL容量瓶中,配成质量浓度约为100 mg/L 的混合标准中间液,分别移取标准中间液适量，用空白基质提取液稀释至所需浓度,配成基质加标混合标准使用溶液。所有标准溶液均在4 ℃下保存,当天使用。
准确称取试样0.5 g(精确至0.1 mg)于50 mL具塞比色管内,加入40 mL水,涡旋混匀1 min后,超声提取15 min,用水定容至50 mL,混匀,以 10000 r/min 速度离心5 min,取上清液过0.2 μ m聚四氟乙烯(PTEF)滤膜,用UPLC-MS/MS检测。
色谱条件 色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH-C18 (100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)。流动相:A为10 mmol/L 乙酸铵溶液,B为乙腈。流速:0.3 mL/min。柱温:35 ℃。进样体积:5 μ L。梯度洗脱程序:0～0.5 min,96%A; 0.5～4.5 min,96%A～70%A; 4.5～5.0 min,70%A; 5.0～5.1 min,70%A～10%A; 5.1～6.0 min,10%A; 6.0～8.0 min,96%A。
质谱条件 离子源:电喷雾正离子模式。采集方式:MRM模式。毛细管电压:1.00 kV。离子源温度:120 ℃。脱溶剂气温度:400 ℃。脱溶剂气流量:700 L/h。锥孔反吹气流量:50 L/h。碰撞室压力:0.27 Pa。其他实验参数见表1。
实验中对Waters ACQUITY UPLC BEH-C18 柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μ m)、Phenomenex Kinetex苯基柱(50 mm×3.0 mm,2.6 μ m)以及资生堂Capcellpak ST柱(150 mm×2.0 mm,5 μ m) 3种色谱柱的分离效果进行了比较。结果表明,苯基柱虽然能明显增加DPS的检测灵敏度,但对其他5个组分灵敏度较低;资生堂Capcellpak ST柱为亲水作用色谱柱,适合极性较大物质的分离,实验发现在该柱上DSH、HMH和DPS均无法正常出峰;而BEH-C18柱对6种染料的分离效果和峰形均较令人满意,因此选择此柱作为分离柱。
比较了水-乙腈、10 mmol/L 乙酸铵-乙腈和0.01%(v/v)甲酸-乙腈流动相体系下6种染料的分离效果。结果表明,水-乙腈体系中6种染料的峰形较宽,0.01%(v/v)甲酸-乙腈体系会造成DSH检测灵敏度的大幅下降,而10 mmol/L 乙酸铵-乙腈体系对6种染料均有较好的峰形和灵敏度。
配制5 mg/L 的6种染料单标准溶液,由注射泵直接进质谱检测,进行一级质谱全扫描,发现在ESI(+)模式下,6种染料均有较好的响应。优化毛细管电压、锥孔电压和干燥气温度、干燥气和辅助气流速,使母离子的响应最大,然后再对母离子进行子离子扫描,调节各染料的碰撞电压等参数。经过优化后最终确定各染料的定量和定性子离子及相应的质谱参数(见表1)。在优化条件下6种染料的定量离子监测图和总离子流色谱图(TIC)见图1。
6种染料均易溶于水中,在有机溶剂中溶解度较小,因此本实验选择水相作为提取溶剂,并比较了水、10 mmol/L 乙酸铵溶液和0.03%(v/v)甲酸溶液的提取效果。结果表明,这3种提取剂对6种染料的提取效果有很大差别,0.03%(v/v)甲酸溶液作为提取剂时DPS、HEPS及CPS峰展宽严重;10 mmol/L 乙酸铵溶液会大大降低HEPS的提取率;而用水作为提取溶剂时色谱峰峰形良好,且具有良好的回收率,因此本实验选用水作为提取溶液。
以空白基质溶液作为标准溶液的稀释液,精确配制一系列浓度的混合标准工作溶液,在优化的色谱-质谱条件下进行测定。分别以各分析物的峰面积(Y)和对应的质量浓度(X,mg/L)进行线性回归计算,得到线性回归方程和线性相关系数(R2),以定量离子色谱峰的S/N=3时的浓度确定方法的检出限,以S/N=10时的浓度确定方法的定量限,结果如表2所示。结果表明,6种染料在相应的质量浓度范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99,检出限为0.26～4.6 mg/kg,定量限为0.86～16 mg/kg,说明本方法完全能够满足国家卫生标准[6]中对这6种染料使用量不大于最大许可含量(MPC)的检测要求。
以不含6种目标分析物的染发膏样品作为空白样品,分别添加高、中、低3个水平的混合标准溶液,进行回收率和精密度试验,每个浓度水平平行测定6次,结果如表3所示。在3个浓度水平下,各待测物的平均回收率为83.0% ～92.2% ,相对标准偏差为5.4% ～11.2% ,能满足实际样品的分析测定要求。
采用该方法对市场上20份不同品牌的染发剂中6种染料的含量进行测定,共有6个样品检出4种染料成分;6种染料除了DPS和HMH在样品中未检出,其他4种染料成分在6个阳性样品中有不同程度的检出,结果见表4。
本文建立了UPLC-MS/MS同时测定染发剂中4,4′-二氨基二苯胺硫酸盐和2,4-二氨基苯酚硫酸盐等6种染料的分析方法。本方法检测速度快,灵敏度高,选择性好,回收率较高,完全能够满足国家卫生标准中对这6种染料使用量不大于1.0% ～10%的检测要求。本方法的建立是对现有的染发剂中染料检测方法的有效补充,为染发剂中染料的检测提供了一种快速、简单、准确的检测技术。
2015, Vol. 33 Issue (1): 17-21
PDF (769 KB)
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