色谱  2014, Vol. 32 Issue (12): 1333-1339   PDF (855 KB)    
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祝伟霞
孙转莲
袁萍
杨冀州
刘亚风
孙武勇
同位素内标-多反应监测同步在线质谱全扫描确证火锅料中罂粟壳成分
祝伟霞, 孙转莲, 袁萍, 杨冀州 , 刘亚风, 孙武勇    
河南出入境检验检疫局, 河南 郑州 450003
收稿日期：2014-9-9
基金项目：河南省科技攻关项目(122102110167);质检总局科研项目(2007IK162).
通讯作者：杨冀州,E-mail:wxzhu121@163.com.
摘要：建立了高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱质谱测定火锅料中吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁等5种生物碱残留的确证方法。样品采用稀盐酸加热提取,正己烷除脂,阳离子混合机理固相萃取柱净化,5%氨化乙酸乙酯-甲醇洗脱,PAK ST色谱柱分离,5 mmol/L乙酸铵甲醇溶液-10 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 3.6)作为流动相洗脱,电喷雾正离子模式下多反应监测同步增强子离子在线全扫描(EPI)。在该实验条件下,5种生物碱的LOD在0.05~0.5 μg/kg之间,增强型子离子全扫描水平限和LOQ在0.2~2 μg/kg之间,方法回收率为64.2%~110.6%, RSD为4.2%~12.5%。阳性样品的定性确证需采用其子离子全扫描质谱图与标准图库中子离子质谱图检索匹配。经测定多种火锅料,表明本方法操作简单、测定结果准确,可用于火锅料中5种生物碱残留的阳性结果确证分析。
关键词： 高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱质谱     增强型子离子全扫描     阳离子固相萃取     生物碱     火锅料    
Determination of poppy ingredients in chafing dish materials by isotopic internal standard coupled with multiple reaction monitoring and online full scan mass spectrometry
ZHU Weixia, SUN Zhuanlian, YUAN Ping, YANG Jizhou , LIU Yafeng, SUN Wuyong    
Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhengzhou 450003, China
Received: 2014-9-9
Abstract: A confirmative method was developed for determining five poppy alkaloids including morphine, codeine, papaverine, tibane, noscapine in chafing dish ingredients by high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry (HPLC-Q Trap MS). The sample was extracted with dilute HCl solution under heating condition. The removal of lipid procedure was performed with hexane. The purification was carried out on a mixed-cation solid-phase extraction column (MCX) and ethyl acetate-methanol containing 5% aqueous ammonia was used for elution. A PAK ST column was used to separate the analytes, and 5 mmol/L ammonium acetate methanol and 10 mmol/L ammonium acetate (pH 3.6) were used as mobile phases. The five alkaloids was detected in the positive mode simultaneously by multiple reaction monitoring (MRM) and online enhanced product ion full scan (EPI). The LODs were 0.05-0.5 μg/kg and the LOQs were 0.2-2 μg/kg for the five poppy alkaloids. The overall recoveries of the method varied from 64.2% to 110.6%, and the RSD were between 4.2% and 12.5%. The EPI mass spectra of positive samples were searched through standard library for qualitative confirmation. The detection of real hot pot material samples showed this method can be used for the simple and accurate determination of the five poppy alkaloid residues in chafing dish.
Key words: high performance liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry (HPLC-Q Trap MS)     enhanced product ion full scan (EPI)     cation solid-phase extraction (MCX)     alkaloids     chafing dish materials    

罂粟壳中残留约0.2%的吗啡和其他生物碱,该浓度含量的生物碱对吸毒者不起作用,但不法分子将其掺入火锅料或调味品吸引消费者,食客吃了这种食品易产生依赖性成瘾。长期食用含有罂粟生物碱的食物会对人类的神经系统、消化系统、内分泌系统造成危害。早在20世纪90年代,卫生部、公安部、工商局联合发布了〔91〕第32号《关于查处在食品中使用罂粟壳(籽)等违法行为的通知》,组织各地依法查处罂粟壳火锅。食品整治办〔2008〕3号公布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》,将火锅料中非法添加罂粟壳作为重点监测项目 (http:/ /www.moh.gov.cn/sps/s7892/201406/38e 5c8a53615486888d93ed05ac9731a.shtml)。为了有效地监督我国火锅料的质量安全,建立一种准确可靠的罂粟生物碱确证分析方法非常必要。

近年来,为了监控毒品交易,研究者在吸毒者毛发[1]、血液[2]、尿液[3]、唾液[4]等生物样本中开展吗啡、可卡因、可待因等违禁生物碱的筛查,常采用分子生物学方法[5]、气相色谱-质谱联用法[6]、液相色谱-荧光检测法[7]、液相色谱-质谱法[2, 3, 4, 8]分析罂粟生物碱。鉴于我国食品安全的现状,国内研究者率先建立了液相色谱-质谱法[9, 10]测定火锅中吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁等5种违禁生物碱的分析方法,并发布1项地方标准[11]。这些方法均是采用液相色谱-质谱的多反应监测(MRM)技术分析食品中5种违禁生物碱。但采用MRM技术检出的火锅料阳性结果不能获得其质谱全扫描确证信息,易产生假阳性结果。本文将样品在模拟食用模式下浸泡提取罂粟壳中5种标志性生物碱,阳离子混合模式固相萃取净化,采用MRM同步在线增强子离子全扫描技术(EPI),根据其质谱信息实现了低浓度目标物的定性鉴定,解决了火锅料中5种特征生物碱阳性确证难题；同时采用同位素内标跟踪准确定量,为执法部门提供了可靠的技术保障。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司),API 5500Q液相色谱-质谱仪(配Q-Trap线性离子阱质谱,美国Applied Biosystems公司); SA-31振荡器(日本大和公司); CF15RXII离心机(日本Hitachi公司); 24位固相萃取装置(德国CNW公司); N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation Associates公司); Oasis MCX柱(6 mL/150 mg,美国Waters公司); 0.2 μ m有机相滤膜(天津津腾公司);吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可丁、20 mg/L 吗啡D3和可待因D3混合标准溶液(中国食品药品检定研究院);甲醇和乙酸乙酯(色谱纯,美国Fisher公司);冰乙酸和乙酸铵(色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司);浓氨水、浓盐酸均为市售分析纯试剂;水为Millipore纯水系统制得的高纯水(电阻率≥18 M Ω \5cm)。

1.2 溶液的配制

分别称取标准品10 mg于100 mL容量瓶中,加入甲醇-水(1:1,v/v)溶解并定容至刻度,得到质量浓度为100 mg/L 的单标准储备溶液,于-18 ℃下冷冻保存,有效期为6个月。取上述单标准储备液,用甲醇-水(1:1,v/v)稀释成质量浓度为1 mg/L 的混合工作溶液,放入冰箱中于2～4 ℃下储存,有效期为1个月。基质标准工作溶液:按照操作方法所述制得空白样品提取液,使用前用其稀释混合标准溶液制成合适浓度的标准工作溶液。同位素内标溶液:取适量吗啡D3和可待因D3标准溶液,用甲醇-水(1:1,v/v)配制成质量浓度为0.8 mg/L 工作溶液。0.125 mol/L 盐酸溶液:将11.25 mL浓盐酸定容到 1 000 mL水中即得。5%氨化乙酸乙酯-甲醇(1:1,v/v):取5 mL氨水加入至95 mL乙酸乙酯-甲醇(1:1,v/v)混合液中即得。5 mmol/L 乙酸铵甲醇:称取0.385 g乙酸铵加入1 mL水溶解后,用1 L甲醇稀释即得。10 mmol/L 乙酸铵溶液(pH 3.6):称取0.77 g乙酸铵加入700水溶解,用冰乙酸调pH 3.6,用水定容至1 L即得。

1.3 仪器条件

色谱柱:CAPCELL PAK ST (150 mm×2.1 mm);柱温:35 ℃;流动相:5 mmol/L 乙酸铵甲醇(A)与10 mmol/L 乙酸铵溶液(pH 3.6)(B);梯度洗脱程序:0～1.0 min,10%A; 1.0～3.0 min,10%A～90%A; 3.0～6.0 min,90%A; 6.0～6.1 min,90%A～10%A; 6.1～10.1 min,10%A。Vaclo六通阀位置:0～1.0 min至废液,1.0～6.0 min进质谱;6.1 min后至废液。流速:0.3 mL/min;进样量:10 μ L。

电喷雾离子源正离子电离(ESI+)MRM模式;雾化气压力:413.7 kPa (60 psi);气帘气压力：172.4 kPa (25 psi);喷雾电压:5 000 V;去溶剂温度:550 ℃;去溶剂气压力:344.8 kPa (50 psi);碰撞气压力:69 kPa (10 psi);每个离子对驻留时间:100 ms;去簇电压(DP): 80 V;每种化合物的检测离子对、碰撞室出口电压(CXP)、射入电压(EP)、碰撞能量(CE)等质谱参数见表1。在线全扫描条件:每次选择2个最强峰,动态背景扣除,不排除前级扫描过的离子,扫描强度阀值为 3 000 cps,EPI扫描范围为m/z 50～450,在CE为35 eV下扫描,其他质谱参数同MRM模式,用标准溶液在MRM-EPI方法下获得子离子扫描质谱图,并建立质谱标准图库,供5种生物碱定性检索用。

表1 5种生物碱的质谱参数 Table 1 MS parameters of the five alkaloids
1.4 样品前处理

称取5.0 g试样于50 mL具塞离心管中,加入50 μ L同位素内标工作溶液,加入25 mL 0.125 mol/L 盐酸溶液,涡旋1 min后,于80 ℃水浴中加热提取30 min,每隔10 min涡旋混匀1 min,取出冷却至50 ℃左右,缓慢加入10 mL正己烷,涡旋混匀2 min,于 4 000 r/min 下离心10 min,弃去上层溶液,待净化。

MCX柱依次用6 mL甲醇、6 mL水、6 mL稀盐酸溶液活化后,将10 mL样液上载至固相萃取柱中,待样液全部流出后用6 mL水、6 mL甲醇淋洗,柱体保持抽干5 min,然后用5 mL氨化乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱,收集洗脱液并用氮气流浓缩至干,加入1 mL 5 mmol/L 乙酸铵甲醇-10 mmol/L 乙酸铵(pH 3.6)(1:9,v/v)溶解残渣,经滤膜过滤后进行仪器测定。

2 结果与讨论
2.1 罂粟生物碱分析对象的选择

为了确定罂粟中主要的生物碱,本方法将粉碎后的罂粟壳0.1 g加入10 mL 1%(v/v)乙酸提取后进行仪器测定,测定结果经归一化计算,检出吗啡50.2% 、可待因8.6% 、罂粟碱5.0% 、那可丁35.5% 、蒂巴因0.5% 、原阿片碱0.2% 。因此本方法将含量较高的吗啡、那可丁、可待因、罂粟碱、蒂巴因作为火锅料中违禁添加罂粟壳的特征标志物。

2.2 提取方法的选择

火锅料富含多种动植物油脂及辛辣物质,样品均匀性差。目前提取火锅料主要采用有机溶剂、强酸或弱酸缓冲液等方法。本方法将阴性火锅料样品添加罂粟壳后,分别试验了乙腈、稀盐酸溶液、pH 5.2的乙酸铵溶液的提取效果,结果表明稀盐酸溶液的测定值最高(吗啡135.2 μ g/kg、可待因27.5 μ g/kg、蒂巴因1.3 μ g/kg、罂粟碱11.6 μ g/kg、那可丁75.4 μ g/kg);乙腈提取时蒂巴因未检出,吗啡、可待因、罂粟碱和那可丁的测定结果均较稀盐酸低35%左右;乙酸铵溶液提取时吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁均低12%左右。因此本方法选用稀盐酸作为提取溶液。

因火锅料食用方法特殊,研究又考察了稀盐酸溶液在不同温度下5种生物碱的提取效果,结果表明温度越高,生物碱提取效率越高,在80 ℃时达到最高,升温至100 ℃,测定值不变。同时加热时间延长,生物碱的测定值也呈线性增加,30 min时最佳。因此本方法选择于80 ℃下提取30 min。

2.3 净化方法的优化

火锅料中罂粟生物碱的提取和净化主要采用液液萃取、QuEChERS和固相萃取等方法。液液萃取是在碱性条件下采用氯仿、乙醚或乙酸乙酯液液萃取,该方法操作复杂,主要用于常规含量样品的分析。本实验考察了QuEChERS法净化5种生物碱的效果。样品经乙腈提取后,经硫酸镁、C18、PSA填料净化后直接测定。该方法操作简单,但基质干扰物多,净化效果差,5种生物碱回收率均在40%左右。本实验还考察了3种固相萃取柱的净化效果:
1.pH 8.5的弱碱性溶液过亲水-亲脂平衡SPE柱(HLB); 2.稀盐酸溶液过强阳离子SPE柱(MCX); 3.乙酸铵缓冲液过弱阳离子SPE柱(WCX)。结果表明以上3种SPE方法对待测生物碱均有较好的富集,试剂标准溶液过柱的洗脱回收率均大于90% ;但受样品基质的影响,HLB柱和WCX柱对火锅料中的目标物回收率为44.1% ～72.5% ,而MCX柱的回收率为73.8% ～94.3% 。因此本方法选用MCX柱作为SPE净化柱。在该SPE方法中,5种待测生物碱与固相萃取填料之间发生阳离子交换作用,反应速度慢,因此在进行固相萃取操作过程中,要控制样液流速小于1 mL/min。

采用添加1.0 mg/kg 的阳性样品试验了5%氨化甲醇、5%氨化乙酸乙酯、5%氨化乙酸乙酯-甲醇(1:1,v/v)等不同溶剂的洗脱效率。分析结果表明9 mL 5%氨化甲醇、12 mL 5%氨化乙酸乙酯、5 mL 5%氨化乙酸乙酯-甲醇可完全洗脱5种生物碱。最终本方法选择5 mL 5%氨化乙酸乙酯-甲醇作为净化柱的洗脱溶剂。

2.4 标准溶液的稳定性考察

为了考察标准溶液的稳定性,在1年时间内测定了标准储备液的稳定性(见图1)。结果表明,180天内5种生物碱测定值的相对标准偏差小于0.05% ;吗啡和可待因240天、那可丁和罂粟碱300天时开始降解;蒂巴因在360天内稳定,测定值的RSD为0.04% 。

图1 标准储备液在不同贮存时间的测定结果 Fig.1 Determination results of standard stock solution

at different storage times
2.5 定量方法的优化

质谱的电喷雾电离模式易产生基质效应。为了考察本方法的基质效应,分别制得试剂标准溶液与基质标准溶液,对比结果发现,5种生物碱均有基质抑制现象,吗啡和罂粟碱的信号响应降低1/2,可待因、那可丁和蒂巴因均降低约4/5。由于每种火锅底料基质是唯一的,基质标准溶液很难制得,因此采用外标法定量时准确度差。为了弥补基质的电离抑制效应,本方法采用同位素内标法定量。

2.6 色谱条件的选择

5种生物碱属极性到中等极性化合物,由于吗啡、可待因的两性电荷特征,2种分析物在普通C18柱中易出现双峰,在高比例水相和有机相中均可被洗脱。方法试验了极性酰胺基柱(Amide)分离5种生物碱的效果,5种分析物在该体系中的保留行为与反相柱相反,水作为强洗脱液,增加其比例可使化合物的保留时间缩短,那可丁和罂粟碱峰形对称,但蒂巴因峰形拖尾,吗啡和可待因色谱峰宽达2 min,调节流动相的pH为3.5～6.0时,色谱峰未改善。采用CAPCELL PAK ST柱分析5种生物碱,结果发现5种分析物均获得对称的峰形,在梯度洗脱条件下,待测化合物保留时间主要在2.0～3.5 min之间。

2.7 质谱参数的优化

采用1 mg/L 单标准溶液以流动注射的方式分别在正、负离子模式下进行母离子全扫描,确定化合物的分子离子。该类化合物的结构使其在正离子模式下易产生强信号[M+H]+峰。再分别以待测物的准分子离子峰为母离子进行子离子全扫描。由子离子质谱图可以看到,吗啡和可待因具有相同的裂解模式,其子离子碎片均是以不稳定多环中间体C13H11O的中性丢失、电子重排获得;罂粟碱、那可丁、蒂巴因的特征碎片均以失去甲基或甲氧基为主要裂解方式[12]。方法选取丰度较强、干扰较小的两对子离子作为定性与定量离子,优化质谱参数时发现,DP对5种待测物影响小,在1～100 V之间时响应强度相同,其他质谱参数见表1。

2.8 假阳性结果的确证

受火锅料基质的影响,在MRM模式下分析时,吗啡常检出“阳性”,虽保留时间有差异,但样品中吗啡两个定性离子同时出现,仍然为定性造成困难。为了提高质谱测定结果的准确性,本方法采用线性离子阱串联质谱(Q-Ttrap MS)的在线EPI全扫描技术,可同时获得其子离子质谱图进行对照分析。方法优化了非动态排除干扰进行扫描时的结果,表明该模式下质谱扫描选择性差;采用动态排除干扰后对最强峰进行扫描,以 3 000 cps作为信号阀值,子离子扫描目标性强,5种生物碱含量在LOQ水平时均可获得子离子扫描质谱图。将获得的子离子全扫描质谱图建立相应标准图库,样品分析完成时可自动检索定性,因此本方法减少了单一MRM模式下的假阳性几率(见图2)。

图2 (a)吗啡标准溶液与(b)吗啡阴性样品质谱图 Fig.2 Comparison of mass spectra of (a) morphine standard solution and (b) negative morphine sample
2.9 方法检出限、定量限、线性范围、添加回收率和精密度

将S/N≥3定义为LOD,S/N≥10定义为LOQ,本方法的LOD、LOQ、线性范围、线性方程(其中X为分析物含量( μ g/kg),Y为分析物与内标物的峰面积比)分别为:吗啡的LOD和LOQ分别为0.5 μ g/kg 和2 μ g/kg,线性范围为1～200 μ g/kg,线性方程为Y=0.051 7X+0.012 8(R=0.999 9);可待因的LOD和LOQ分别为0.2 μ g/kg 和1 μ g/kg,线性范围为0.5～200 μ g/kg,线性方程为Y=0.054 9X+0.002 29(R=0.999 9);蒂巴因的LOD和LOQ分别为0.05 μ g/kg 和0.2 μ g/kg,线性范围为0.1～200 μ g/kg,线性方程为Y=0.265X-0.012 7(R=0.999 9);那可丁的LOD和LOQ分别为0.05 μ g/kg 和0.2 μ g/kg,线性范围为0.1～200 μ g/kg,线性方程为Y=0.286X+0.12(R=0.999 5);罂粟碱的LOD和LOQ分别为0.05 μ g/kg 和0.2 μ g/kg,线性范围为0.1～200 μ g/kg,线性方程为Y=0.050 5X+0.124(R=0.999 7)。

在阴性麻辣火锅汤液、火锅底料、火锅调味料、火锅肉汤等样品中,分别添加LOQ、2倍LOQ、4倍LOQ 3个水平的标准溶液,每个水平平行测定10次,内标法定量,由表2可见回收率范围为64.2% ～110.6% ,RSD为4.2% ～12.5% 。

表2 阴性样品中5种生物碱的加标回收率和精密度 Table 2 Recoveries and precisions of the five alkaloids spiked in blank samples
2.10 实际样品测定

采用该方法对691个火锅料实际样品进行了检测,共检出9个阳性样品，测定结果见表3；阳性样品均采用MRM同步在线子离子扫描质谱方法确证,质谱图经标准数据库检索,匹配度达90%以上,其特征碎片、离子丰度比、保留时间相同,可确认为阳性。图3为其中1个样品的MRM色谱图和EPI质谱图。

表3 9个阳性样品的检测结果 Table 3 Results of nine positive samples

图3 阳性火锅样品的MRM色谱图和EPI质谱图 Fig.3 MRM chromatograms and EPI mass spectra of a positive hot pot sample a. morphine; b. codeine; c. tibane; d. noscapine; e. papaverine.
3 结论

本研究在着重解决火锅底料中罂粟壳成分阳性确证问题的基础上,提出了酸溶液加热提取-固相萃取浓缩与净化的前处理方法,结合MRM-EPI技术进行定性,同位素内标法定量,完成了罂粟壳中5种特征生物碱的准确测定。该方法快捷可靠,可直接用于分析基质复杂的火锅料、调味品、肉汤等样品中的生物碱成分,并已成功应用于餐饮市场抽查样品的检测,为火锅料中违禁罂粟壳的监督提供了可靠的技术基础。鉴于目前仍然存在一些不法商家添加罂粟壳至食品中的现象,准确有效地检测火锅底料中禁用罂粟壳成分具有重要的现实意义。

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