色谱  2014, Vol. 32 Issue (11): 1271-1274   PDF (977 KB)    
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张权青
张磊
高小迪
张维冰
张庆合
基于大体积循环进样的低丰度蛋白质富集
张权青1, 张磊2, 高小迪2, 张维冰2, 张庆合1     
1. 中国计量科学研究院, 北京 100029;
2. 华东理工大学, 上海市功能性材料化学重点实验室, 上海 200237
收稿日期：2014-9-11
基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ09016703,2012YQ120044);国家自然科学基金重点项目(21235005).
通讯作者：张庆合,E-mail:Qhzhang204@gmail.com.
摘要：发展了一种大体积循环进样方法,用于富集低丰度蛋白质。在优化的色谱分离条件下,通过增加蛋白质样品的上样体积提高低丰度蛋白质的绝对含量;进一步采用增加样品进样循环次数的方法提高蛋白质的富集效率。以猪肝提取蛋白质为样品,每次上样量500 μL的大体积11次循环进样。根据色谱峰的信号强弱,选择了在原始谱图中看不到色谱峰、有较少小峰和有较多小峰出现的时间段等有代表性的馏分进行研究。在中等极性的组分中,保留时间为11.38 min和12.58 min组分的富集效率分别提高了52倍和61倍,实验结果与理论富集效率相近。所发展的方法为生物蛋白质样品研究提供了一种新的富集制备及检测方法。
关键词： 大体积进样     循环     蛋白质     低丰度     猪肝     富集    
Protein enrichment based on large volume recycling injection
ZHANG Quanqing1, ZHANG Lei2, GAO Xiaodi2, ZHANG Weibing2, ZHANG Qinghe1     
1. National Institute of Metrology, Beijing 100029, China;
2. East China University of Science and Technology, Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, Shanghai 200237, China
Received: 2014-9-11
Abstract: Biological proteins have great differences in size, hydrophobicity, pH and relative abundance. Especially, the relative contents of high-abundance proteins and low abundance proteins can reach 11 orders of magnitude or more in blood. However, the contents of proteins which have an important impact on the biological function and have related to major diseases are usually very low in body fluids or tissues. So, it is very meaningful to detect the low abundance proteins in biological samples. A method of large volume recycling injection was developed as a new sample enrichment technology in this study. The low absolute contents of proteins in a sample were improved by increasing the volume of sample, and the enrichment efficiency was also increased with the addition of injection times. With the pork liver protein as an example, under the optimized conditions, the representative contents which were no peaks or little peaks and more peaks with low signals were studied. The contents of peaks at the retention times of 11.38 min and 12.58 min were enriched by 11 time injections of 500 μL each time. The enrichment factors respectively reached 52 and 61 which were closed to theoretical values. This method can be used for the enrichment of biological protein samples.
Key words: large volume injection     recycling     proteins     low abundance     pork liver     enrichment    

生物蛋白质在大小、相对丰度、酸碱度和疏水性等方面具有很大的差异。就相对含量而言,血液中的高丰度与低丰度蛋白质含量甚至相差达11个数量级,这也导致一些低丰度蛋白质很难被分析检测和研究。对生物功能产生重要影响的修饰蛋白质、与重大疾病相关的蛋白质在体液或组织中的含量通常很低,也使对低丰度蛋白质检测方法的研究成为生物分析领域的一个重要研究课题。

对蛋白质样品中低丰度组分的检测通常需采用预富集的方法,通过提高其相对含量来有效地提高检测灵敏度和检测精度。常用的蛋白质富集技术主要有固相金属离子亲和色谱法(IMAC)[1, 2, 3]、分子印迹技术[4]、亲和色谱技术[5]、特殊选择性材料富集[6, 7]、循环进样[8, 9]等。固相金属离子亲和色谱法[10]是最常用的蛋白质富集方法之一,钱小红等[11]利用二氧化钛对腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质进行富集研究,鉴定到25个磷酸化蛋白质;梁鑫淼等[12]利用氧化铝进行糖肽的选择性富集,从辣根过氧化物酶解液中获得16个糖肽,从IgG酶解液中获得12个糖肽。通过蛋白质印迹聚合物材料去除样品中的高含量蛋白质,可以有效避免其对低丰度蛋白质检测的影响,能够将中低含量蛋白质的鉴定数量提高20%以上[13]。

循环进样方式可以有效提高色谱分析的绝对上样量。Lv等[8]采用循环进样结合超高效液相色谱(UPLC)-四极杆飞行时间质谱对白花前胡中的6种同分异构体进行了分离和鉴定。杜敏等[9]发展了一种基于微流控芯片的生物样品循环给样富集方法,大大提高了信号强度,降低了检出限。本文发展了一种大体积循环进样的方法,通过增加进样量与进样次数提高蛋白质样品的富集效率。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

依利特P1201系列高效液相色谱系统(配UV1201紫外-可见波长检测器,大连依利特分析仪器有限公司);超纯水仪(德国Sartorius公司); Heal Force Neofage 1600R高速离心机(力康生物医疗科技控股有限公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司);乙酸(色谱纯)、乙酸铵(分析纯)(上海凌峰化学试剂有限公司);三氟乙酸(色谱纯,上海晶纯试剂有限公司);液氮(普通氮气,上海松闵气体技术有限公司)。

1.2 猪肝蛋白质的提取

参考文献[14]的蛋白质提取方法,取新鲜猪肝10 g,搅拌碾磨成泥浆,加入10倍体积的5%(v/v)乙酸溶液,在4 ℃下搅拌过夜;在室温下以 10000 g离心30 min后取上清液;沉淀中加入等体积乙酸混合,相同条件下离心,合并上清液,得猪肝蛋白质样品。猪肝蛋白质样品用流动相溶解后过0.45 μ m油膜后备用。

1.3 实验条件

色谱柱:SinoChrom ODS-BP色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m,大连依利特分析仪器公司);流动相:A为0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液,B为0.1%TFA乙腈溶液。线性洗脱程序:0～10 min,5%B～40%B; 10～13 min,40%B～100%B; 13～20 min,100%B。流速:1.0 mL/min;检测波长:210 nm;柱温:室温。

2 结果与讨论
2.1 猪肝蛋白质分离条件的优化

210 nm和280 nm为生物蛋白质样品通常的检测波长。在相同分离条件下,210 nm时的色谱峰信号响应明显强于280 nm,因此选择210 nm作为检测波长进行实验。

流动相的种类与梯度条件对样品的分离有着重要的影响。以SinoChrom ODS-BP色谱柱进行反相液相色谱分离流动相条件优化,在最佳色谱分离条件(见1.3节)下得到图1所示的分离结果。

图1 猪肝蛋白质的反相液相色谱分离谱图 Fig.1 Chromatogram of pork liver separated by RPLC Column: SinoChrom ODS-BP (250 mm×4.6 mm,5 μ m); mobile phase: H2O containing 0.1% TFA (A); ACN containing 0.1% TFA (B). Gradient: 0-10 min,5%B-40%B; 10-13 min,40%B-100%B; 13-20 min,100%B. Flow rate: 1 mL/min; volume: 25 μ L; detection wavelength: 210 nm.
Retention times: peak 1,4.57 mim; peak 2,9.88 min.
2.2 进样的重复性

在大体积循环进样中,通过增加进样次数来增加样品的绝对进样量。根据色谱基本原理,在线性色谱条件下,同一物质在同样的色谱分离条件下保留时间不变,因此在多次色谱实验中对相同保留时间段进行收集,得到的馏分应包含相同的组分。进样重复性的好坏,直接影响到组分收集的一致性。

通过3次重复进样,每次25 μ L,考察在优化的色谱分离条件下猪肝蛋白质分离的重复性。图1中峰1(4.57 min)和峰2(9.88 min)峰高的RSD(n=3)分别为5.9%和5.5% ,表明系统及所发展的方法具有良好的进样重复性。

2.3 低丰度组分的选择与富集效率的评价

根据RPLC的洗脱原理,不同极性组分主要依靠疏水性进行分离。相对而言,在0~10 min对应的是强极性流动相，其收集的馏分为弱保留组分;在10~13 min对应的流动相极性逐渐减弱，将其收集的馏分定义为中等极性组分。根据色谱峰的信号强弱,选取保留时间为7～9 min、11～13 min的中等极性组分及17～19 min的较强保留组分作为研究对象评价方法。保留时间为9～11 min时,色谱峰的信号较强,经过循环进样富集后信号饱和,因此未选取此组分段进行研究。

采用大体积循环进样的方式,进样11次,每次上样量500 μ L。依次收集选择的保留时间段的组分,并将其分别合并后,氮气吹干,用流动相B溶解定容,再次进行色谱分离。

图2中比较了经过循环富集后17~19 min的中等极性组分与原始图谱的差别。图3和图4中分别比较了7～9 min、11～13 min的中等极性组分与原始谱图的差别。

图2 猪肝蛋白质17～19 min组分 富集(a)前、(b)后的色谱图 Fig.2 Chromatograms of 17-19 min fraction of pork liver proteins (a) before and (b) after enrichment

图3 猪肝蛋白质11～13 min组分 富集(a)前、(b)后的色谱图 Fig.3 Chromatograms of 11-13 min fraction of pork liver proteins (a) before and (b) after enrichment

图4 猪肝蛋白质7～9 min组分富集 (a)前、(b)后的色谱图 Fig.4 Chromatograms of 7-9 min fraction of pork liver proteins (a) before and (b) after enrichment

从图2～图4可以看出,采用循环富集的方法可以将不同时间段馏分有效去除,而其他富集目标组分的含量得到有效提高。显然,这种方法可同时用于高丰度蛋白质的去除以及低丰度蛋白质的富集。

在理想情况下,对于所收集到的馏分,其中每一种组分的绝对量为进样次数与进样体积以及其在原始样品中浓度的乘积。对于17～19 min馏分中的每一种组分而言,其在富集后再次溶解的50 μ L样品中的浓度的理论值应为其在原始样品中浓度的110倍。17～19 min时间段的组分中,富集前因浓度太低谱图中未出现色谱峰;经过大体积的循环进样后,出现了新的色谱峰,其对应的保留时间为18.07、18.29和19.15 min。

对于11～13 min的馏分以及7～9 min的馏分,用流动相B溶解至100 μ L,其理论富集倍数皆为55,选择在富集前只有微弱信号的8.81、8.92、11.38与12.58 min组分进行研究,结果见表1。可以看出,试验与理论富集倍数相近,说明所发展的方法具有很好的稳定性和重复性。

对于不同的色谱峰,实际富集倍数有一些差别。可能是因为原始色谱图中组分丰度很低,定量结果误差较大,使得富集倍数的计算产生较大偏差,但这一现象并不影响所发展方法的实用性。

表1 不同色谱峰的富集效果 Table 1 Enrichment results of different chromatographic peaks
3 结论

本文发展了一种大体积循环进样的蛋白质样品富集分离处理方法,也可用于去除高丰度蛋白质对低丰度蛋白质检测的干扰。通过增加蛋白质样品的上样体积,提高低丰度蛋白质的绝对含量;进一步采用增加样品进样循环次数的方法,提高蛋白质的富集效率。实验与理论富集效率相近。所发展的方法为生物蛋白质样品研究提供了一种新的富集制备及检测方法。

参考文献
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[14]Huang P. [Master Dissertation]. Changsha: Central South University of Forestry and Technology (黄平.[硕士学位论文]. 长沙: 中南林业科技大学), 2009