有机氯农药曾被广泛推广在全球范围内作为杀虫剂使用,其中六六六(BHC)和滴滴涕(DDT)是使用最早、应用最广的有机氯农药(organochlorine pesticides,OCPs)[1]。自20世纪70年代起,六六六和滴滴涕虽相继被停止生产及使用,但由于其化学性质稳定,不易分解,长期在自然环境中迁移、富集,各种环境介质、动植物及人体内仍可检出,残留污染问题非常严重。
蜂蜜是蜜蜂从蜜源植物中采集花蜜并经过自身酿造的一种天然甜味物质,由于其高营养价值而广泛应用于食品行业。然而蜜源植物和蜜蜂体内的农药残留可能污染蜂蜜,从而危害人体健康[2, 3, 4]。因此,蜂蜜中的农药残留分析越来越受到重视[5, 6]。目前,蜂蜜中六六六和滴滴涕类农药残留的常见测定方法有气相色谱法和气相色谱-质谱联用法,常用前处理方法有液液萃取和固相萃取等[7, 8, 9]。具有有机溶剂用量大、费时、费力的缺点。因此,有机溶剂用量少、操作简单的前处理方法是目前样品前处理分析的发展方向。
分散液液微萃取(DLLME)是2006年开始发展起来的一种新型前处理方法,其原理是微量萃取剂在分散剂作用下形成分散的有机微液滴,均匀的分散于样品水溶液中,从而形成水/萃取剂/分散剂乳浊液体系,目标分析物被萃取到有机相中,最后在水样及微量萃取剂之间达到萃取平衡[10]。DLLME是一种操作简单、快速、富集效率高且有机溶剂用量少的环境友好型前处理方法,其在蜂蜜样品中农药残留分析检测中的应用已见报道,如Jovanov等[11]采用了分散液液微萃取与液相色谱-质谱联用法结合测定了蜂蜜中新烟碱类农药残留,Zhang等[12]分别采用了传统的和3种改进的分散液液微萃取技术结合高效液相色谱对蜂蜜中拟除虫菊酯类农药残留进行了检测分析。本实验以三氯甲烷为萃取溶剂,乙腈为分散剂,建立了分散液液微萃取与气相色谱-质谱法联用快速检测蜂蜜中六六六和滴滴涕类农药残留分析方法。该方法简便、快速、富集效率高,且方法灵敏度与精密度良好,符合农药残留分析要求。
岛津QP2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司),Vortex QL-901涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司),TDZ5-WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司),Sartorius电子天平(1/1000) (北京赛多利斯天平有限公司),10 mL玻璃离心管,50 μ L微量注射器。乙腈、三氯甲烷、四氯乙烯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、正己烷(分析纯,北京化工厂),去离子水。
六六六( α -BHC,β -BHC,γ -BHC,δ -BHC)及滴滴涕(p,p′-DDT,o,p′-DDT,p,p′-DDE,p,p′-DDD)混合标准储备液质量浓度为100 mg/L(农业部环境保护科研监测所)。
蜂蜜样品购自当地超市。
100 mg/L 的标准储备液用正己烷逐级稀释至所需浓度,置于-20 ℃冰箱内保存。
准确称取25 g蜂蜜样品,加入500 mL蒸馏水振荡溶解,制成50 g/L 均匀蜂蜜样品溶液,室温放置待用。
取5 mL(空白或标准添加)样品溶液至10 mL玻璃离心管,加入70 μ L三氯甲烷(提取剂)和1.1 mL乙腈(分散剂)的混合溶液,涡旋1 min,三氯甲烷均匀分散在样品溶液中,目标分析物从样品溶液进入三氯甲烷微滴。混合样品溶液以 2200 r/min 离心3 min,三氯甲烷在底部与样品溶液分层,用50 μ L微量注射器取出三氯甲烷相至进样瓶衬管中,待测。
GC分析条件:DB-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m); He载气(纯度＞99.999% );柱头压 65000 Pa;载气恒线速度36.8 cm/s;不分流进样,进样体积1 μ L;进样口温度260.0 ℃。色谱柱升温程序:80.0 ℃(保持0.5 min),以15.0 ℃/min 的速率升温至250.0 ℃(保持1 min),以30.0 ℃/min 的速率升温至300.0 ℃(保持5 min)。
MS分析条件:电子轰击电离模式(EI),电子能量70 eV; EI源温度200 ℃,GC-MS接口温度250 ℃;溶剂延迟时间4 min,扫描范围m/z 50～500。
富集倍数(enrichment factor,EF)和萃取回收率(extraction recovery,ER)是评判DLLME方法性能的重要参数。EF是萃取后分析物在萃取剂有机相中的浓度(C0)与萃取前分析物在样品水溶液中的浓度(C)之比,即。ER是萃取后有机相中的分析物含量(n0)相对于样品中所有分析物含量(n)的百分比,即,式中V0和V分别为萃取后有机相体积与萃取前水相体积。本实验采用外标法定量。
取50~200 g/L 范围内样品溶液分别进行了实验,由于蜂蜜基质中丰富的糖类、氨基酸及蛋白质等复杂化合物的存在,实验过程中样品溶液离心分层时在水相和三氯甲烷相之间有一层白色悬浮物(可能为糖类),且随着样品溶液浓度增加,白色悬浮物增加,三氯甲烷相体积减小,方法的重现性和准确性都不稳定,因此实验选用50 g/L 的样品溶液。
色谱柱类型和柱升温程序等色谱条件是影响目标化合物分离效果及检测灵敏度的主要因素。实验表明:使用DB-5 MS毛细管色谱柱在优化的色谱条件下可使8种六六六和滴滴涕类农药有效地分离,且分析物具有良好的色谱行为。
在m/z 50～500范围内对8种六六六和滴滴涕类农药的溶剂标准溶液进行全扫描,获得总离子流色谱图(TIC),确定各种农药的保留时间、定性和定量离子,即SIM(selected ion monitoring)模式的分析条件。定性离子尽量选择相对分子质量较大、相对丰度较高且干扰较少的离子,定量离子则是相对丰度为100%的离子。SIM模式分析条件如表1所示。
选择合适的萃取剂是提高萃取效率的关键, DLLME技术中常用萃取剂需具备以下几个特点: (1)密度大于样品水溶液,且水溶性小;(2)不易挥发;(3)对分析物具有良好的萃取能力;(4)良好的色谱行为等。本实验分别对二氯甲烷、三氯甲烷和四氯乙烯作为萃取剂进行了研究。结果表明,二氯甲烷作为萃取剂的方法重现性和回收率都最差;四氯乙烯与三氯甲烷对分析物的平均回收率相近,但四氯乙烯的重现性没有三氯甲烷的好;三氯甲烷作为萃取剂时所有分析物的RSD＜16% 。
萃取剂体积决定了方法的富集倍数与萃取效率。萃取剂体积越小,方法富集倍数越高;但体积太小时不能充分提取,可能导致方法回收率过低,重现性较差。本实验研究了三氯甲烷体积在50～90 μ L范围内的方法富集倍数和萃取效率。实验结果如图1所示,三氯甲烷体积越小,方法富集倍数越高,目标化合物的平均峰面积越高(50 μ L除外,可能体积太小,无法充分提取目标化合物)。但体积较小时重现性较差;另一方面,三氯甲烷体积太小,导致不能使用自动进样器进样分析。因此综合考虑方法性能和实验操作性,三氯甲烷体积选择70 μ L。
分散液液微萃取中,分散剂需要具备以下特点:(1)与萃取剂和样品水溶液具有很好的混溶性,同时不影响样品混合溶液在分层时形成两相;(2)不干扰目标化合物分析,具有良好的色谱行为。因此分散剂的选择影响萃取微滴及最终萃取相体积,进而影响方法的富集倍数和萃取效率。选择70 μ L三氯甲烷与1 mL分散剂,对常用分散剂甲醇、乙腈和丙酮进行了实验,结果表明甲醇影响萃取相与样品水溶液的分层效果,最终萃取相体积最小,萃取效率最低,这可能是由于甲醇与水的高互溶性;乙腈与丙酮对目标化合物的平均回收率相近,但方法重现性方面,使用乙腈时的RSD≤9.3% ,而使用丙酮时RSD≤29.8% 。因此实验选择乙腈作为分散剂。
分散剂的体积直接影响萃取剂在水溶液中微滴的形成及大小,从而影响萃取效率。实验在700～1300 μ L乙腈体积范围内研究了分散剂体积的影响。实验结果如图2所示,在700～1100 μ L范围内萃取效率随着乙腈体积增大而升高,而乙腈体积在 1100～1300 μ L范围时萃取效率随着乙腈体积增大开始下降。由于乙腈体积在一定范围内增大时,三氯甲烷在样品水溶液中形成更均匀小液滴,提取更充分;当乙腈体积较大时分析物在水中溶解度增大导致萃取效率降低。因此实验选择乙腈体积为 1100 μ L。
萃取时间是指往样品水溶液中加入萃取剂和分散剂后至混合溶液离心前的时间。实验对萃取时间在0.5～10 min范围内进行了研究,结果表明,萃取时间1 min时比0.5 min时的萃取效率有较大增加;1 min后,萃取效率随萃取时间增加没有较大变化。分散液液微萃取中,由于萃取剂与水溶液接触面积大,分析物在两相之间很快达到萃取平衡,因此萃取时间较短。实验选择萃取时间为1 min。
离心是为了使三氯甲烷相与水溶液分离,离心速度较小可能不能使三氯甲烷相完全与水溶液分离,影响萃取效率。实验对离心速度在 2000～3000 r/min 范围内进行了研究。实验结果如图3所示,在 2000～2200 r/min 范围内分析物的平均峰面积随着离心速度增加而增加,2200～3000 r/min 范围内分析物平均峰面积几乎不变,而离心速度越大玻璃离心管也越容易破裂,导致实验失败。因此实验选择离心速度为 2200 r/min。
在农药残留分析中,基质效应是指样品中分析物以外的组分对分析及方法准确性的干扰。与纯溶剂相比,基质可能导致分析物信号增强或抑制。蜂蜜的成分复杂,基质效应不可忽视。实验分别以正己烷和空白蜂蜜基质溶液作为溶剂配制溶剂标准溶液和基质标准溶液,通过在100 μ g/kg 添加水平下分别使用溶剂标准曲线和基质标准曲线定量样品中8种六六六和滴滴涕类农药的添加回收率来考察基质效应,结果如表2所示:在100 μ g/kg 添加水平下,8种六六六和滴滴涕类农药用溶剂标准溶液定量的回收率都大于用基质标准溶液定量的回收率,且除了 γ -BHC和p,p′-DDE外,其余6种六六六和滴滴涕类农药溶剂标准曲线定量的回收率都大于120% ,基质标准曲线定量的8种六六六和滴滴涕类农药的回收率则为67.7% ～96.2% 。说明蜂蜜基质对分析物表现出基质增强效应，蜂蜜基质对分析物的信号有增强作用,这可能是由于蜂蜜中含丰富的糖类、蛋白质、氨基酸等杂质,这一基质效应干扰目标分析物检测。因此,为了最大限度降低基质效应的影响,确保实验结果的准确性,实验中采用基质标准曲线定量。
以空白基质作为溶剂准确配制2～500 μ g/L 范围内(2、5、10、20、50、100、200、500 μ g/L)系列梯度混合基质标准溶液,按1.2.4节实验条件进行测定,以所得分析物峰面积(Y)对分析物质量浓度(X,μ g/L)作标准曲线,结果如表3所示:8种六六六与滴滴涕类农药在2～500 μ g/L 范围内均线性关系良好,相关系数(r2)为0.991～0.998。根据中华人民共和国农业行业标准NY/T 788-2004 确定8种六六六和滴滴涕类农药的最低检测浓度(LOQ)均为20 μ g/kg,最小检出量(LOD)皆为1.0 ng,方法富集倍数(EF)为74～96。表明所建立方法的灵敏度较高,有一定富集效果,适合蜂蜜样品中微量六六六和滴滴涕类农药残留检测。
在5 mL蜂蜜样品中分别添加20、50、100 μ g/kg 3个水平的六六六与滴滴涕类农药混合标准溶液,每个添加水平5个重复,按实验方法进行处理分析。结果如表4所示:当试样的加标水平为20、50和100 μ g/kg 时,加标回收率分别为71.7% ～100.1% 、61.0% ～76.9%和67.7% ～96.2% ,相对标准偏差(RSD,n=5)分别为6.3% ～19.5% 、2.2% ～19.5%和4.4% ～15.5% 。本方法回收率在60% ～120%范围内,相对标准偏差均低于20% ,符合农药残留分析要求。蜂蜜空白样品和100 μ g/kg 添加水平样品中8种六六六和滴滴涕类农药的SIM模式下总离子流色谱图(TIC)如图4和图5所示。
从当地某大型超市购买10种蜂蜜样品,应用所建立方法进行检测。结果显示除3种蜂蜜样品中检出了六六六或滴滴涕类农药外,其余蜂蜜样品均未检出六六六和滴滴涕类农药。其中1号蜂蜜样品检出p,p′-DDD和p,p′-DDT,残留量分别为26.5和20.4 μ g/kg; 8号蜂蜜样品检出 β -BHC、 δ -BHC、p,p′-DDT、o,p′-DDT、p,p′-DDE和p,p′-DDD,残留量分别为104.3、30.9、166.7、219.1、175.0和198.5 μ g/kg; 9号蜂蜜样品检出p,p′-DDD和p,p′-DDT,残留量分别为33.4和29.5 μ g/kg。这一方面是由于其化学性质稳定,不易降解,早期使用的农药在环境介质中仍存在;另一方面则是由于近年来大量三氯杀螨醇农药在我国农业生产中的使用,国产三氯杀螨醇农药商品中含4% ～10%的DDT。9号蜂蜜样品在SIM模式下的总离子流色谱图如图6所示。
本文建立了将分散液液微萃取作为前处理方法,采用气相色谱-质谱法测定蜂蜜中六六六和滴滴涕类农药残留量的分析方法。分散液液微萃取集采样、萃取和浓缩于一体,萃取时间短,且方法准确、灵敏,适用于蜂蜜样品中六六六和滴滴涕类农药微量残留的快速检测。
2015, Vol. 33 Issue (1): 40-45
PDF (810 KB)
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