巯基化合物在自然界中广泛存在,且在生物体内参与多种重要的生理过程。巯基化合物在植物对重金属抗性机制中的作用研究进行得较为深入、广泛,其中植物螯合肽(PCs)被认为是起主要作用的能与金属结合的蛋白[1]。植物螯合肽是植物体内在重金属诱导下产生、由酶催化以谷胱甘肽(GSH)为底物合成的一类低相对分子质量巯基多肽,包含共同的结构特征( γ Glu-Cys)n-X(n=2～11,X是三肽的C-端氨基酸,Glu为葡萄糖,Cys为半胱氨酸)[2, 3]。PCs含有丰富的Cys残基,能通过Cys的巯基(-SH)结合细胞内的游离金属离子,降低细胞内可扩散的金属离子浓度,从而增强植物抵抗重金属胁迫的能力,因此PCs可以作为重金属毒害效应标记物[4, 5, 6]。水稻是人类主要的粮食作物,镉污染已成为部分水稻产区不容忽视的食品安全问题,而巯基化合物的研究是水稻重金属防御机制研究中较为重要的一个方面。因此对水稻中巯基化合物进行快速、准确的测定,将为探明水稻中重金属耐性机制的研究提供重要的技术手段。
由于巯基化合物的极性较强，易氧化、难保留,且在紫外光区无吸收、无荧光特性,因此柱前或柱后衍生技术成为目前巯基化合物分析的常用手段[7, 8, 9, 10, 11]。其中最经典的方法是Ellman试剂(5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸),DTNB)柱后衍生紫外检测法[12],但该方法需要特殊的柱后反应器,且存在分析时间长、灵敏度不够高(检出限为nmol量级)等缺点。柱前衍生液相色谱-质谱联用技术虽具有较高的灵敏度(检出限可达pmol量级),但仪器设备昂贵,分析费时[13, 14]。目前虽然也有不经衍生直接采用液相色谱-质谱联用方法测定水稻中巯基化合物的报道[15],但其金属复合物容易在色谱柱上发生吸附、解离和交换,导致分辨率和选择性较低,因而该方法未得到很好的应用。柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法因灵敏度高、选择性高和重现性好的优点成为巯基化合物测定的一种较有效的手段。常用的柱前衍生试剂有单溴二胺(monobromobimane,mBrB)[16]、7-苯并呋喃-4-磺酸铵(ammonium 7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonate,SBD-F)[17]和o-苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPT)[18]等。其中mBrB柱前衍生测定法因其衍生化过程快、分离效果较好、灵敏度较高、检出限可达pmol量级,在巯基化合物的测定中获得广泛应用。目前关于拟南芥、土豆、血液等[2, 16, 17]基质中巯基化合物的提取、分离、测定方法的研究相对较多,且多集中于PC2～4的测定,而针对水稻中7种巯基化合物同时分析的报道较少。因此,本实验通过优化前处理及检测条件,建立了一种同时分析水稻中Cys、GSH以及PC2～6等7种巯基化合物的柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法。该方法过程简便、分离度好、灵敏度高、重现性好,为巯基化合物在水稻重金属抗性机制中的作用研究提供了技术支持。
1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司),配有G1321A型荧光检测器;冷冻离心机(美国ThermoFisher公司); PHS-3C精密pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);电热恒温振荡水槽XMTD-8222(上海精宏实验设备有限公司)。
PC2(H-( γ Glu-Cys)2-Gly-OH)、PC3(H-( γ Glu-Cys)3-Gly-OH)、PC4(H-( γ Glu-Cys)4-Gly-OH)、PC5(H-( γ Glu-Cys)5-Gly-OH)、PC6(H-( γ Glu-Cys)6-Gly-OH)标准品(纯度＞98% ,美国AnaSpec公司);谷胱甘肽(GSH,纯度＞98% )、Cys(纯度＞98% )、衍生试剂mBrB(纯度＞95% )、4-羟乙基哌嗪丙磺酸(HEPPS,纯度＞99.5% )、三氟乙酸(TFA,纯度99% )(美国Sigma公司);甲磺酸(MSA,纯度＞99% )、二乙烯三胺五乙酸(DTPA,纯度＞99% )(美国Fluka公司);乙腈(ACN,色谱纯,美国Fisher公司);去离子水(由Milli-Q纯化水系统制得)。
分别称取适量各巯基化合物标准品,用0.1%TFA溶液(含6.3 mmol/L DTPA)配制成质量浓度均为100 mg/L 的单标准储备液,置于4 ℃下保存。使用时,根据需要逐级稀释成不同质量浓度的混合标准工作液。
水稻植株(日本晴,由中国水稻研究所提供)参照李鹏等[19]的水培方法,待水稻4叶期时进行Cd2+胁迫处理,处理浓度为50 μ mol/L(以CdCl2形态加入),同时以不加Cd2+处理为对照(CK),Cd2+胁迫处理1周后结束并取样。水稻根部用自来水反复冲洗干净,置于预冷的10 mmol/L CaCl2溶液中静置10 min,以去除根表面吸附的Cd2+,然后用去离子水冲洗干净,最后用吸水纸将其表面水分吸干。将新鲜样品分成叶片、茎和根3部分,分别称取一定的鲜样组织用液氮(-196 ℃)迅速冷冻,再置于-80 ℃冰箱中储存。
参照Sneller等[20]的方法,取上述水稻植物鲜样放入研钵中，加入液氮并研磨至粉末状;称取0.5 g,加入2 mL 0.1%TFA(含6.3 mmol/L DTPA,pH 1.0)充分混匀,冰浴超声30 min后于 12000 r/min、4 ℃下离心10 min,收集上清液。为避免巯基化合物接触空气而氧化损失,立即进行柱前衍生化反应，即向250 μ L 7种巯基化合物标准液或植物组织上清液中加入450 μ L 200 mmol/L HEPPS(含6.3 mmol/L MDTPA,pH 8.2)和10 μ L 25 mmol/L mBrB充分混合,于50 ℃下反应30 min，然后加入300 μ L 1 mmol/L MSA终止反应,摇匀,过0.45 μ m滤膜后,转移至Agilent棕色顶空瓶内,4 ℃下保存至HPLC分析测定。同时作试剂空白衍生化反应,确定试剂空白杂质峰。
色谱柱:Agilent Eclipse plus Cl8柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:A为0.1%TFA水溶液(pH 2.5),B为100%ACN;流速:0.8 mL/min。梯度洗脱程序:0～3 min,10%B; 3～15 min,10%B～20%B; 15～25 min,20%B～35%B; 25～30 min,35%B～100%B; 30～35 min,100%B; 35～45 min,10%B。柱温:30 ℃;进样量:10 μ L;荧光检测波长:激发波长为380 nm,发射波长为470 nm。
采用水和乙腈进行二元洗脱时,发现目标物保留较弱且不稳定,峰拖尾;而且基质干扰较为严重,目标物难以定量。参照Qiu等[14]的方法,在水相中添加0.1%TFA时,上述现象得到极大改善,目标物保留相对较强,且能够实现与杂质的分离。
实验考察了流动相A的pH值(1.0～4.0)对各色谱峰的出峰时间、峰形、灵敏度与噪声的影响。结果表明:pH值从4.0降低至2.5时,7种巯基化合物的灵敏度均增加,各色谱峰的保留时间明显缩短;pH为2.5时,GSH和杂峰达到基线分离;pH值继续降低,5种植物螯合肽PC2、PC3、PC4、PC5和PC6的灵敏度仍随之增加,而Cys的灵敏度、GSH与杂峰的分离选择性均降低。兼顾分离度和灵敏度的要求,实验选择流动相A的pH值为2.5。
改变0.1%TFA(A)-乙腈(B)的比例,各种巯基化合物的保留时间会发生明显变化,特别是GSH和PC6容易受溶剂峰的干扰,有机相的比例以及洗脱时间对这两个物质的分离至关重要。为调整7种巯基化合物出峰时间以获得更好的峰形,并尽量减少杂质峰干扰,本实验采用梯度洗脱方法。
在优化的色谱条件下,对混合标准溶液进行测定。从图1中可以看出,7种巯基化合物能够较好地分离和检出。
植物中具有还原性的巯基化合物大多分布在细胞质内,采用在冰浴中超声提取方式有利于提高提取效率;同时,在碱性条件下,还原态的巯基很容易被氧化成氧化态的二硫键,因此提取过程中提取液的pH值对巯基化合物的提取回收率有较大的影响。本研究考察了酸度调节剂的种类、提取液的pH值、提取方式及时间对待测物提取效率的影响(以PC2为例,结果见图2)。当分别使用硫酸、盐酸和磷酸3种酸度调节剂调节提取液pH值为1.0时,PC2的提取效率均达到最高,分别为92.45% 、95.02% 、84.23% ,其中盐酸对PC2的提取效率更好。然后考察了简单的溶剂提取和超声提取对水稻巯基化合物提取效率的影响。结果表明,超声提取法有利于巯基化合物从细胞质中溶出,提取效率较高。提取效率随着提取时间的延长而增加,至30 min时最高,30 min以后巯基化合物因接触空气氧化损失导致提取效率逐渐下降。因此,实验选择盐酸作为酸度调节剂,pH 1.0的0.1%TFA(含6.3 mmol/L DTPA)为提取液,超声浸提时间30 min。
mBrB的衍生化反应与环境pH值密切相关,pH值过低或者过高时均会影响反应进行,甚至不能反应,因此本文比较了HEPPS缓冲液的pH值(7.6～8.4)对衍生效率的影响。结果显示,pH值从7.6升高到8.0时,Cys、GSH和PC2～6 7种巯基化合物的衍生效率分别提高了6.24% 、7.21% 、7.74% 、6.74% 、6.96% 、6.75%和4.89% ; pH增大到8.4时,GSH和Cys衍生效率无显著变化,但PC2～6的衍生效率下降了1.94% ～4.45% 。故选用pH 8.0的HEPPS溶液(200 mmol/L)为衍生缓冲液。
本文分别考察了不同温度(35、40、45、50、55、60 ℃)衍生30 min对7种巯基化合物衍生效率的影响。结果显示,温度变化对Cys和GSH的转化率影响不明显,而PC2～6的转化率随着温度的升高而增加,在50 ℃时衍生效率最大,分别为96.14% 、95.46% 、94.89% 、94.21%和93.38% ；温度高于50 ℃后呈下降趋势，故本文选择衍生温度为50 ℃。在50 ℃下,分别衍生10、20、30、40、50、60 min,考察反应时间对衍生化效率的影响。衍生化时间从10 min增加到30 min,7种巯基化合物衍生效率提高了16.17% ～29.54% ;从30 min增加到60 min,衍生化效率趋于稳定，故衍生时间选择为30 min。
将7种巯基化合物的混合标准溶液逐级稀释成系列标准工作溶液,在优化的色谱条件下分析。以峰面积(Y)为纵坐标,质量浓度(X,mg/L)为横坐标,计算各巯基化合物的回归方程、相关系数和线性范围。由表1可见,在0.7～100.0 mg/L 范围内,7种巯基化合物呈良好的线性关系,线性相关系数均大于 0.9991。按3倍信噪比得到各化合物的检出限,检出限为0.03～0.20 mg/L(见表1)。
取对照植株根部进行加标回收试验,添加水平分别为1.0、5.0和10.0 mg/kg,每个添加水平平行测定6次,加标回收率为89.26% ～99.42% ,相对标准偏差为2.05% ～5.87%(见表2)。
按照上述优化方法对不同处理条件下水稻不同部位中巯基化合物的含量进行测定,结果见表3,其中空白对照以及Cd2+处理后的水稻根样品的色谱图见图3。由表3可知,未经Cd2+处理的水稻叶片、茎和根中只检出Cys和GSH,而经50 μ mol/L Cd2+处理7 d后,除了Cys和GSH,还检测到PC2和PC3,其中叶片、茎和根中PC2含量分别为0.986、0.543、1.169 mg/kg,PC3含量分别为5.170、3.176、7.689 mg/kg;在各部位含量分布规律均表现为根＞叶片＞茎,且PC3的含量均高于PC2。这说明水稻在Cd2+暴露下,可诱导合成PCs。另一方面,高Cd2+处理水平下GSH含量相比空白对照有显著降低,原因是GSH作为底物被用于合成PCs。
本文建立了柱前衍生高效液相色谱测定水稻中7种巯基化合物的分析方法。通过优化水稻中7种巯基化合物的柱前衍生及色谱条件,进一步提高了衍生效率,改善了巯基化合物在反相C18柱上的保留。该方法分离效果理想,灵敏度高,满足巯基化合物定量分析的测定要求,为进一步检测水稻生长过程中PCs的合成、转运与介导重金属脱毒害的分子机理等相关研究提供了技术支持。
参照Sneller等[20]的方法 ...
2015, Vol. 33 Issue (1): 35-39
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