近年来,医药和个人护理化学品(PPCPs)作为一类新型污染物因其对环境存在的潜在危害引起了广泛的关注[1, 2, 3]。抗生素作为一类常见的PPCPs,除了用于疾病的治疗和预防外,也被大量地用于畜牧业和水产养殖。抗生素可通过污水处理厂出水、医药废水、养殖废水等多种途径进入环境[4, 5]。环境中存在的抗生素可诱导细菌出现抗药性,影响生态平衡[6, 7],人体接触环境中残留的抗生素可引起过敏反应和增加癌症发病风险[8]。
由于环境基质复杂多样,环境中抗生素的分析受到了挑战,而目前没有可用于环境样品中多种抗生素分析的标准方法。已有的抗生素分析方法包括薄层色谱法、毛管电泳法、酶联免疫法和结合固相萃取(SPE)的色谱分析[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]，如高效液相色谱-紫外/荧光检测(HPLC-DAD/FLD)[12, 13]、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)[14, 15]、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)[16, 17]及超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)[18]等。由于基于多反应监测(MRM)模式的HPLC-MS/MS技术具有特异性强、灵敏度高、线性动态范围宽等特点,在抗生素分析中应用最为广泛。例如高立红等[19]使用电喷雾离子化正离子(ESI+)扫描MRM模式可在33 min内对3类22种抗生素进行分析;Zhang等[20]使用三重四极杆质谱可在MRM模式下30 min内完成4类13种抗生素的同时分析;杨常青等[21]采用电喷雾正负离子切换(ESI+/ESI-)MRM模式可在10 min内分析4类16种抗生素。然而，已报道的这些研究工作一般分析抗生素的类别较少,或者相对耗时较长,因此,对多类别多种抗生素快速准确分析方法的开发就显得格外重要。本研究采用SPE-HPLC-MS/MS技术,建立了水中6类23种抗生素的同时定量分析方法,包括大环内酯类(macrolides)、磺胺类(sulfonamides)、青霉素类(penicillins)、氯霉素类(chloramphenicols)、氟喹诺酮类(fluoroquinolones)和利福平(rifampicin)等,可在30 min内完成全部目标抗生素分析,并成功应用于5个海水养殖池水中目标抗生素的测定。
固相萃取仪(Auto Trace 280,美国Thermo公司)、氮吹仪(HGC-12,天津市恒奥科技发展有限公司)、高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(LC1100-6410B,美国Agilent公司)。
标准品:罗红霉素 (roxithromycin)、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine)、 磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxypyrimidine)、磺胺甲基异恶唑(sulfamethoxazole)、磺胺吡啶(sulfapyridine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、阿莫西林(amoxicillin)、青霉素G(penicillin G)、氯霉素(chloramphenicol)、氟甲砜霉素(florfenicol)、甲砜霉素(thiamphenicol)、左氧氟沙星(ofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、恩诺沙星(enrofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、利福平、万古霉素(vancomycin)和氘代磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole-d4,100 ng/ μ L，溶剂为乙腈)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;阿奇霉素(azithromycin)购自英国Fluorochem公司;克拉霉素(clarithromycin)购自上海TCI公司。纯度均高于98% ,满足定量分析需要。
甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)购自美国Sigma公司,甲酸(分析纯)购于天津市科密欧化学试剂有限公司,甲酸铵(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司,超纯水(18.2 M Ω ·cm,25 ℃)由Heal Force超纯水系统(上海力康公司)提供。
标准溶液的配制:准确称取标准品 0.010 0 g,用甲醇制成质量浓度为1 g/L 的标准储备液,保存于-20 ℃冰箱中。使用时用初始流动相稀释。
在2014年6月,采集了东营海水养殖区5个海水养殖池水样。养殖池水深2 m以内,所采集样品均为表层水。每个养殖池中一次性采集水样4 L,置于棕色玻璃瓶中,在低温条件下保存并运回实验室,1周之内完成所有水样前处理过程。
色谱柱:Xterra C18(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m,美国Waters公司);进样量:5 μ L;柱温:40 ℃;流动相:0.1%(v/v)甲酸-1 g/L 甲酸铵水溶液(A),甲醇-乙腈(1 ∶ 1,v/v)(B)。梯度洗脱程序:起始5%B,保持3 min;在30 min内线性变为88%B。流速0.3 mL/min。
质谱条件：ESI+/ESI-切换;MRM数据采集模式。每种抗生素的详细质谱检测参数见表 1。
水样经0.45 μ m玻璃纤维滤膜过滤,准确量取1 L,加入回收率替代物氘代磺胺甲恶唑50 ng,用盐酸-水溶液(1 ∶ 1,v/v)调节pH至2.5,在Oasis HLB SPE小柱(500 mg/6 mL)上进行富集。上样前,SPE柱依次用20 mL甲醇、6 mL超纯水和6 mL盐酸溶液(pH 2.5)活化平衡;上样时流速设为10 mL/min;上样后先用10 mL超纯水淋洗萃取小柱,用氮气吹扫5 min,最后用甲醇洗脱。洗脱液在40 ℃水浴中用氮气吹至近干,用初始流动相(5%B)溶解残渣,定容至1 mL,过0.22 μ m水相滤膜,待测。
6类抗生素的质谱行为不同,氯霉素类在ESI-模式下有较强响应,在ESI+下信号非常弱,而其他几类抗生素正好相反。因此本方法中选择正、负离子模式同时监测,一次性对所有目标抗生素进行分析,减少了分析所用时间。
分别考察了Waters Xterra色谱柱和Agilent Zorbax Eclipse XDB C18液相色谱柱(150 mm×3.0 mm,3.5 μ m)对抗生素的分离效果,结果显示Xterra色谱柱效果更佳。对比甲醇、乙腈和不同比例甲醇-乙腈作流动相时抗生素的分离情况,结果表明甲醇可以改善峰形,而乙腈可以提高分离度,在甲醇-乙腈体积比为1 ∶ 1的条件下各物质峰形、响应值和分离度达到最佳状态。由于液相色谱-质谱分析中样品溶剂组成也会影响分析物的保留时间和峰形,从而影响对目标化合物检测的灵敏度。因此本研究考察了甲醇和初始流动相作为样品溶剂对色谱分离的影响。甲醇作样品溶剂时,经过梯度洗脱,抗生素能够完全分离,但响应值偏低且色谱峰出现前伸现象(见图 1a),严重影响定量分析结果;而采用初始流动相(5%B)时,各物质的响应和峰形都得到很大改善(见图 1b)。
亲水亲脂平衡(HLB)型固相萃取柱,对极性和非极性物质都有很好的回收率和重复性,因此常被用于类似研究中。本实验选择了Oasis HLB SPE柱(500 mg/6 mL)作为萃取柱,优化了上样pH。溶液pH可以影响抗生素在水中的存在形态、稳定性和与萃取柱填料之间的相互作用,从而影响萃取效果。对比酸性、中性(未调节pH)和碱性条件下HLB柱对目标抗生素的富集效果,发现大部分抗生素在酸性条件下的回收率最高(见图 2),因此确定上样pH为2.5。
取1 L超纯水,调节其pH至2.5,在其中添加抗生素混合标准工作液100 μ L,经HLB柱富集,淋洗吹干后用不同量的甲醇进行洗脱。结果显示,以6 mL甲醇洗脱两次,效果较好;继续增加洗脱液量,洗脱效果增加不明显,且会增加后续处理的工作量。因此,以12 mL甲醇分两次对萃取柱进行洗脱,既保证了各抗生素都能有较高的回收率,又减小了洗脱液体积,有效地缩短了整个分析时间。
在提取样品前添加回收率指示物,以控制整个样品前处理过程的回收率。同时进行方法空白和平行样的测定,以进行质量控制与质量保证。
根据仪器对23种目标抗生素的响应以及水样中抗生素可能的浓度,以初始流动相为溶剂配制抗生素混合标准工作液,并稀释成5个系列梯度浓度。经分析获得工作曲线,所有目标物的线性相关系数(r2)均大于0.995(见表 2)。采用王艳洁等[22]介绍的国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)推荐方法 测定并计算方法检出限(MDL),除阿莫西林为8.5 ng/L,其他目标抗生素为0.1～2.9 ng/L。在低、中和高3个添加水平下考察方法回收率(n=3)分别为 47.3% ～122.2% 、53.9% ～132.6% 、58.6% ～125.7% ,相对标准偏差(RSD)分别为1.6% ～18.8% 、0.6% ～14.5% 、1.2% ～13.8% (见表 3),表明该方法具有较好的重现性和稳定性。
使用所建立的方法对东营地区5个养殖海水样品中的抗生素进行分析,水样中共检出6种抗生素,总质量浓度在7.4～378.9 ng/L 之间,该结果与Zhang等[18]在莱州湾采集的水样中检测到的抗生素含量相当,且海参养殖池水中抗生素总浓度明显高于对虾池。如表 4所示,大环内酯类中罗红霉素共检出2次,平均质量浓度为0.8 ng/L;磺胺类中磺胺甲恶唑在3个水样中被检出,平均质量浓度为0.3 ng/L,而磺胺增效剂甲氧苄氨嘧啶检出频率为100% ,检出质量浓度可达98.2 ng/L;氯霉素类中甲砜霉素和氟甲砜霉素被检出,其中氟甲砜霉素检出质量浓度最高,达到261.0 ng/L;氟喹诺酮类中恩诺沙星被检出1次,检出质量浓度为18.7 ng/L;利福平检出1次,检出质量浓度为0.3 ng/L。同时对所检出6种抗生素在高添加水平(参见表 3)下的模拟海水(盐度35.0‰)进行了加标试验,回收率的结果分别为罗红霉素74.5% 、磺胺甲恶唑53.9% 、甲氧苄胺嘧啶77.9% 、氟苯尼考71.6% 、恩诺沙星65.9%以及利福平64.1% 。所检出的抗生素基本涵盖了所有目标种类,显示出本方法对实际水体抗生素分析的实用性和有效性。
本研究采用SPE-HPLC-MS/MS技术建立了水中6类23种抗生素同时测定的分析方法,结果表明该方法具有较好的灵敏度和稳定性。用该方法对东营某海水养殖区5个养殖池水样进行了初步检测,除青霉素类外各类抗生素均有检出,证明该方法可用于实际水样的分析。
2015, Vol. 33 Issue (4): 348-353
PDF (869 KB)
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