色谱  2015, Vol. 33 Issue (1): 84-89   PDF (1245 KB)    
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李国柱
孟庆艳
罗碧
葛振红
刘文杰
循环制备液相色谱分离芳香新塔花中的化学成分
李国柱, 孟庆艳, 罗碧, 葛振红, 刘文杰     
塔里木大学生命科学学院, 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室, 新疆 阿拉尔 843300
收稿日期：2014-09-22
基金项目：国家自然科学基金项目(21365018);新疆生产建设兵团科技攻关项目(2011AB030);新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室开放课题(BRYB1404).
通讯作者：刘文杰,E-mail:lury@sina.com
摘要：建立了交替循环和直接循环液相色谱相结合的方法用于制备芳香新塔花中的化学成分.芳香新塔花样品经溶剂提取、柱色谱和中压制备色谱初步分离后得到芳香新塔花的不同馏分.以甲醇-水为流动相,利用双柱交替循环法对组分进行分离,同时,流动相经恒流泵循环输入色谱柱.以馏分Ⅰ和馏分Ⅱ为例,在混合循环模式下分离得到5个化合物.通过核磁共振对其进行鉴定,确定分别为乔松素-7-O-芸香糖苷、白杨素-7-O-芸香糖苷、金合欢素-7-O-芸香糖苷、云杉素和原儿茶酸.实验结果表明,该制备方法分离效率高,节省流动相,是分离天然产物的有效手段.
关键词： 交替循环     直接循环     制备色谱     化学成分     芳香新塔花    
Isolation of chemical constituents from Ziziphora clinopodioides Lam. with recycling preparative high performance liquid chromatography
LI Guozhu, MENG Qingyan, LUO Bi, GE Zhenhong, LIU Wenjie     
College of Life Science, Tarim University, Key Laboratory of Protection & Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps, Alar 843300, China
Received: 2014-09-22
Abstract: The combination of alternate recycling and direct recycling preparative liquid chromatography method was developed for the isolation of chemical constituents from Ziziphora clinopodioides Lam. The crude extract was obtained from Ziziphora clinopodioides Lam. by solvent extraction, column chromatography and reversed-phase (RP) flash chromatography. All the separations were performed with methanol and water as mobile phases and the developed recycling preparative method was used with twin RP columns switched by a two-position ten-way valve for the separation. The mobile phase was recycled in close loop with a two-position six-way valve. The fraction Ⅰ and fraction Ⅱ from reversed-phase flash chromatography were selected for the demonstration of separation power of the proposed protocol, and five compounds were obtained from Ziziphora clinopodioides Lam. The isolated five compounds were identified as pinocembrin-7-O-rutinoside, pinocembrin-7-O-rutinoside, acacetin-7-O-rutinoside, picein and protocatechuic acid with nuclear magnetic resonance (NMR). The experimental results showed that the developed preparation method exhibited higher separation efficiency with less mobile phase used than the reported methods, and could be expected as an effective method for the separation of complex natural products, especially the compounds with similar structures.
Key words: alternate recycling     direct recycling     preparative liquid chromatography     chemical constituents     Ziziphora clinopodioides Lam.    

芳香新塔花为唇形科(Lamiaceae)新塔花属(Ziziphora)植物(Ziziphora clinopodioides Lam.)干燥地上部分,其主要药理作用为治疗高血压、心脏病、哮喘多汗、咳嗽、水肿、支气管、肺脓疡和其他疾病。有关芳香新塔花的化学成分研究国内外都有报道。国外学者的研究主要集中在芳香新塔花挥发油的成分及药理作用[1, 2];国内学者对芳香新塔花挥发油及全草的化学成分均有研究[3, 4, 5]。化学成分研究表明,芳香新塔花全草中的主要化学成分为挥发油、黄酮、生物碱、维生素、有机酸、苷类等。但芳香新塔花的化学成分研究尚不深入,其物质基础还没有充分进行研究。

天然产物研究中常见的分离纯化方法有常规柱色谱法、制备高效液相色谱法、高速逆流色谱法等。但是对于天然产物中的许多化合物,包括对映体、非对映体、异构体或者结构相似保留时间非常相近的化合物,很难用上述方法从复杂的混合组分中直接分离得到[6, 7, 8, 9, 10]。循环制备液相色谱作为一种快速发展的技术,可用于分离天然产物中的复杂组分。该制备系统通过连续的循环操作方式实现模拟长柱的色谱分离效果,获得了比传统长色谱柱更高的分离效率[11]。

在液相色谱的发展过程中,再循环技术在改进凝胶色谱低柱容量上首先得到应用[12]。根据再循环的方式不同,循环制备液相色谱主要分为交替循环液相色谱和直接循环液相色谱两种。交替循环由两根色谱柱和一个切换阀组成,通过阀的切换将分离组分交替循环输入两根相同的色谱柱,以连续的循环操作方式达到预期的分离效果。直接循环由一根色谱柱和一个切换阀组成,通过控制阀的切换将溶剂和分离组分循环输入同一色谱柱反复进行分离,以实现化合物的分离纯化。Lan等[13]利用双柱交替循环制备分离结构相似的化合物。Alley等[14]利用双柱交替循环液相色谱从糖复合物中分离纯化结构具有细微差异的同分异构体,分离出结构非常相近的麦芽三糖和异麦芽三糖。Sidana等[15]利用直接循环液相色谱分离出松三糖,其纯度达到94.7% 。Sidana等[16]利用直接循环液相色谱从斜脉桉的叶子中分离出同分异构体euglobal A和euglobal B。Nakatsu等[17]利用直接循环液相色谱从Esenbeckia leiocarpa的叶子中分离出两种喹啉酮类生物碱,分别是leiokinine A和leiokinine B。

直接循环法分离天然产物中的化学成分,其优点是只使用一根色谱柱,而且节省溶剂。但在分离过程中,检测器、管路和恒流泵均参与了再循环过程,为了减少色谱柱外的混合,恒流泵的泵头柱塞体积不能太大,同时,恒流泵输液流速需较低,因而采用直接循环模式分离时间较长，效率低,循环的次数有限,不能充分利用色谱柱的分离能力。双柱交替循环法分离天然产物中的化学成分时,整个分离过程在色谱柱中进行,柱外混合程度较低,而且可以使用较高的溶剂流速,分离效率比单柱直接循环法高。但是,由于溶剂不参与循环过程,在分离的组分结构比较相近,循环次数较多时,需要消耗大量的流动相。

本文构建了交替循环和直接循环液相色谱相结合的方法,以二位十通切换阀实现分离的组分在两根色谱柱内循环分离,同时,流动相通过六通阀进行切换参与循环。建立的系统可由3种方式对复杂样品进行单独分离纯化,包括交替循环液相色谱、直接循环液相色谱以及交替循环和直接循环液相色谱联用分离方式。交替循环和直接循环液相色谱联用的方法与单独的交替循环或直接循环液相色谱相比,操作灵活,克服了单一使用时的缺点,对复杂样品的分离既可以节省溶剂,又能提高化合物的分离效率。以芳香新塔花中极性相似,保留时间相近的几种化合物的混合馏分为例,利用建立的方法对其进行分离纯化,对天然产物复杂样品的分离纯化有一定的借鉴意义。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

分析型仪器:岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司),配有LC-20AT二元梯度泵、SPD-M20A紫外检测器、柱温箱和自动进样器。

制备型仪器:STI 501型液相色谱仪(杭州赛智科技有限公司),配有高压输液泵、UV-501检测器、7725i进样阀;Rheodyne TianMX二位十通阀(美国Rheodyne公司); 8725i二位六通阀(美国Rheodyne公司);中压制备液相色谱系统(瑞士步琪有限公司),配有C-605型二元梯度液相泵、C-640型紫外检测器、C-620型控制单元、C-660型馏分收集器、进样单元、C-690型玻璃色谱柱(230 mm×36 mm)。

样品浓缩仪器:RE-2008B旋转蒸发仪(上海瑞兹机电设备有限公司);真空冷冻浓缩仪(潍坊三水检验设备有限公司)。

试剂:分析纯甲醇、氯仿(天津市致远化学试剂有限公司);色谱级甲醇(美国Sigma公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

材料:芳香新塔花药材采自新疆昌吉州木垒县龙王庙水库(北纬N43°47′28.92″,东经E90°16′11.62″),经西南民族大学民族药物研究所刘圆教授鉴定为唇形科新塔花属植物Z. clinopodioides Lam.的干燥地上部分;柱层析硅胶(200～400目，上海盛亚化工有限公司);玻璃色谱柱反相C18填料(50 μ m,日本YMC公司); Waters Xbridge (250 mm×4.6 mm,5 μ m)和Waters Xbridge (250 mm×19 mm,5 μ m)色谱柱(美国Waters公司)。

1.2 实验方法
1.2.1 样品制备

称取芳香新塔花全草6.0 kg,用70%(v/v)乙醇浸提3次,每次48 h,抽滤合并滤液,浓缩干燥得粗提物。粗提物经硅胶柱(100.0 cm×7.0 cm)分离,以氯仿-甲醇(100 ∶ 1、100 ∶ 10、100 ∶ 50、100 ∶ 100,如无特殊说明均为体积比)和甲醇梯度洗脱,每段洗脱3个柱体积(BV)。将所得的氯仿-甲醇(100 ∶ 10)洗脱组分经中压柱色谱分离,以甲醇-水(10 ∶ 90、30 ∶ 70、60 ∶ 40)梯度洗脱,流速为20 mL/min,每段洗脱750 mL。经HPLC检测,甲醇-水(10 ∶ 90)馏分中各成分之间的分离度都比较好,经高效制备液相色谱可得到很好的分离;甲醇-水(60 ∶ 40)馏分中主要成分为保留时间非常相近的化合物,经常规柱色谱或高效制备液相色谱很难得到很好的分离,将其作为馏分Ⅰ;甲醇-水(30 ∶ 70)馏分中含有多种主要成分,经高效制备液相色谱分离得到单体化合物和一种由两个极性相近化合物组成的混合物,将该混合物作为馏分Ⅱ。以馏分Ⅰ和馏分Ⅱ为例,利用建立的混合循环模式制备HPLC分离。

1.2.2 色谱条件

分析型色谱条件:色谱柱为Waters Xbridge (250 mm×4.6 mm,5 μ m);流速为1 mL/min;温度为40 ℃;检测波长为267 nm;进样浓度为1 g/L;进样量为20 μ L。馏分Ⅰ,流动相为甲醇-水(65 ∶ 35)，等度洗脱10 min;馏分Ⅱ,流动相为甲醇-水(30 ∶ 70)，等度洗脱10 min。

循环制备色谱条件:色谱柱为Waters Xbridge (250 mm×19 mm,5 μ m);流速为15 mL/min;进样量为 1 000 μ L,样品质量浓度为100 g/L;其余与分析型色谱条件相同。

2 结果与讨论
2.1 交替循环和直接循环液相色谱联用方法的建立

本文建立的交替循环和直接循环液相色谱联用方法如图1所示。图1中A-D和C-D分别为该制备系统的直接循环模式的开路和循环状态;A状态固定,系统处于独立交替循环模式,B和D分别为交替循环的两个状态;通过六通阀的切换(A或C)和十通阀的切换(B或D)实现直接循环和交替循环混合模式。具体操作顺序如下:a.在进样前制备系统处于A-B状态,样品完全进入色谱柱1分离后进入检测器,通过观察峰信号确定待分离组分已完全通过色谱柱1进入色谱柱2时,切换十通阀到A-D状态。b.样品经过色谱柱2后直接流入色谱柱1，再次分离后进入检测器；观察峰信号，待需要的组分将要响应时,切换十通阀至A-B状态。通过二位十通阀的切换,去除杂质，只保留目标组分,最终系统位于A-D状态。c.切换六通阀至C-D状态,目标组分与流动相依次经过色谱柱2和色谱柱1，同时参与循环；观察峰信号，待目标组分中某化合物达到完全分离后切换到A-D状态。d.收集已完全分离的馏分,将未完全分离的混合组分再次进入直接循环状态,连续操作直至所有化合物完全分离,观察峰信号依次收集所有馏分。

图1 交替循环和直接循环液相色谱系统分离示意图 Fig.1 Schematic diagrams of alternate recycling and direct recycling preparative liquid chromatography A. The six-way valve in the load position; B. samples through ten-way valve into chromatographic column 1,then through detector and chromatographic column 2; C. the six-way valve in the inject position; D. samples through ten-way valve into chromatographic column 2,then through chromatographic column 1 and detector.
2.2 馏分Ⅰ和馏分Ⅱ在混合循环模式制备液相色谱条件下的分离

馏分Ⅰ的HPLC分析谱图如图2a所示,可以看出,该组分用普通分析柱难以分离。按照2.1节所述方法步骤，色谱柱用流动相平衡后,在进样前,该制备系统处于A-B状态。通过进样阀进样后当样品完全进入色谱柱1时,二位十通阀切换到A-D状态。经条件摸索,样品首次通过色谱柱1保留时间为9 min时不收集组分,去除目标组分前面的杂质峰后立刻切换到A-B状态。目标组分完全进入色谱柱2,保留时间为13 min时,通过二位十通阀再次切换到A-D状态,去除目标组分后面的杂质峰。保留时间为26 min时,收集目标组分的第一个单体化合物(FT-1),收集完后立刻切换到A-B状态。保留时间为34 min时,再次切换到A-D状态。此时切换六通阀至C状态,该制备系统处于C-D状态,目标组分和流动相进行直接循环。当目标组分中有达到完全分离的馏分时,将六通阀状态由C切换至A处于A-D状态,收集完分离完全的组分时,再切换到C-D状态,即收集组分时,制备系统处于开路状态,收集完组分时待分离组分和流动相处于循环状态。连续操作,当保留时间为52 min和83 min时,分别收集第二个(FT-2)和第三个单体化合物(FT-3),总运行时间为86 min,制备色谱图如图2b所示。根据直接循环系统开路与循环的时间,与交替循环法相比,节约流动相约60%。建立的混合模式制备液相色谱流动相参与循环时,样品组分结构越相近,循环次数越多,流动相节省比例越大。

图2 馏分Ⅰ的(a)液相色谱分析谱图和(b)循环制备色谱图 Fig.2 (a) Analytical and (b) recycling preparative HPLC chromatograms of fraction Ⅰ Analytical column: Xbridge (250 mm×4.6 mm,5 μ m); flow rate: 1 mL/min. Preparative column: Xbridge (250 mm×19 mm,10 μ m); flow rate: 15 mL/min. Mobile phases: methanol (B) and water (A). Isocratic elution: 65%B for 90 min. Detection wavelength: 267 nm. Injection volume: 1000 μ L. Sample mass concentration: 100 g/L.

采取同样的方法用于馏分Ⅱ中化合物的分离纯化。在保留时间为23 min时,该制备系统进行直接循环,样品和流动相参与循环。在保留时间为51 min和64 min时,分别收集两个单体化合物(FT-4和FT-5),总运行时间为68 min,液相色谱分析谱图和制备色谱图如图3a和3b所示。与交替循环法相比,节约流动相约66%。

图3 馏分Ⅱ的(a)液相色谱分析谱图和(b)循环制备色谱图 Fig.3 (a) Analytical and (b) recycling preparative HPLC chromatograms of fraction Ⅱ Analytical column: Xbridge (250 mm×4.6 mm,5 μ m); flow rate: 1 mL/min. Preparative column: Xbridge (250 mm×19 mm,10 μ m); flow rate: 15 mL/min. Mobile phases: methanol (B) and water (A). Isocratic elution: 30%B for 75 min. Detection wavelength: 267 nm. Injection volume: 1000 μ L. Sample mass concentration: 100 g/L.

将分离得到的各个组分浓缩冻干,得到单体化合物FT-1、FT-2、FT-3、FT-4和FT-5,质量分别为12、27、18、9和5 mg；经液相色谱分析,色谱峰纯度分别为96.8% 、99.5% 、99.7% 、96.5%和97.1% ,分析色谱图如图4所示。以核磁共振对其进行解析,确定5个化合物分别为乔松素-7-O-芸香糖苷、白杨素-7-O-芸香糖苷、金合欢素-7-O-芸香糖苷、云杉素和原儿茶酸,结构图见图5。

图4 FT-1、FT-2、FT-3、FT-4和FT-5的液相色谱分析谱图 Fig.4 Analytical HPLC chromatograms of FT-1, FT-2,FT-3,FT-4 and FT-5 Column: Xbridge (250 mm×4.6 mm,5 μ m); mobile phases: methanol (B) and water (A). Isocratic elution: 20%B. Injection volume: 10 μ L. Flow rate: 1 mL/min.

图5 FT-1、FT-2、FT-3、FT-4和FT-5的化学结构 Fig.5 Chemical structures of FT-1,FT-2,FT-3, FT-4 and FT-5
2.3 结构鉴定

FT-1:淡黄色粉末(甲醇),UV λ max: 284、330 nm;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz) δ : 7.54(2H,d,J=7.2 Hz,H-2′,6′),7.42(2H,t,J=7.2 Hz,H-3′,5′),7.38(1H,t,J=7.2 Hz,H-4′),6.16(2H,d,J=1.6 Hz,H-6,8),5.65(1H,dd,J=3.2,10.0 Hz,H-2),4.98(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),4.53(1H,brs,J=7.2 Hz,H-1),3.71～3.75(1H,m,H-3″),3.59～3.66(1H,m,H-5″),3.51～3.58(1H,m,H-2″),3.37～3.44(1H,m,H-5),3.20～3.28(1H,m,H-4″),3.02～3.20(1H,m,H-3),2.85～2.87(1H,m,H-2),2.81～2.83(1H,m,H-4),3.78～3.86(1H,m,H-6″),2.47～2.53(2H,m,H-3),1.09(3H,t,J=6.4 Hz,H-6);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz) δ : 79.0(C-2),42.5(C-3),197.2(C-4),162.9(C-5),96.0(C-6),165.6(C-7),97.0(C-8),163.5(C-9),103.8(C-10),138.9(C-1′),129.0(C-3′,4′,5′),127.3(C-2′,6′),99.8(C-1″),73.4(C-2″),76.0(C-3″),71.1(C-4″),76.7(C-5″),66.4(C-6″),103.8(C-1),70.7(C-2),77.2(C-3),70.0(C-4),72.5(C-5),18.3(C-6)。波谱数据与文献[18]报道的数据一致,故鉴定化合物为乔松素-7-O-芸香糖苷。

FT-2:黄色粉末(甲醇),UV λ max: 267,305 nm;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz) δ : 7.06(1H,s,H-3),6.49(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.82(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),8.09(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),7.62～7.64(2H,m,H-3′,5′),7.59～7.61(1H,m,H-4′),5.09(1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),4.54(1H,brs,H-1),1.07(3H,d,J=6.5 Hz,H-6);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz) δ : 164.3(C-2),105.0(C-3),182.6(C-4),161.6(C-5),100.2(C-6),163.5(C-7),95.3(C-8),157.5(C-9),106.1(C-10),131.0(C-1′),127(C-2′,6′),129.7(C-3′,5′),132.6(C-4′),100.2(C-1″),73.5(C-2″),76.7(C-3″),70.3(C-4″),76.1(C-5″),66.5(C-6″),101.0(C-1),70.8(C-2),71.2(C-3),72.5(C-4),68.8(C-5),18.3(C-6)。化合物通过异核单量子关系(HSQC)、多键碳氢关系(HMBC)和氢-氢二维空间相关(ROESR)等二维核磁共振谱解析,确定该化合物为白杨素-7-O-芸香糖苷。

FT-3:白色结晶(甲醇),UV λ max: 267、334 nm;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz) δ : 6.95(1H,s,H-3),6.46(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.78(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),8.05(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),7.14(2H,d,J=9.0 Hz,H-3′,5′),3.87(3H,s,-OCH3),5.08(1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),4.56(1H,brs,H-1),1.08(3H,d,J=6.5 Hz,H-6);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz) δ : 164.4(C-2),104.3(C-3),182.5(C-4) 161.6(C-5),100.4 C-6),163.4(C-7),95.2(C-8),157.4(C-9),105.9(C-10),123.1(C-1′),128.9(C-2′,6′),115.2(C-3′,5′),162.9(C-4′),100.4(C-1″),73.5(C-2″),76.7(C-3″),70.8(C-4″),76.1(C-5″),66.5(C-6″),101.1(C-1),71.1(C-2),71.2(C-3),72.5(C-4),69.0(C-5),18.3(C-6)。波谱数据与文献[19]报道的数据一致,故鉴定化合物为金合欢素-7-O-芸香糖苷。

FT-4:淡黄色粉末(水),UV λ max: 213、264 nm;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz) δ : 7.91(2H,d,J=8.8 Hz,H-2,6),7.10(2H,d,J=8.8 Hz,H-3,5),2.52(3H,s,H-8),5.01(1H,d,J=7.6 Hz,H-1′),2.89-3.79(m,sugar-H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz) δ : 131.3(C-1),130.7(C-2),116.3(C-3,5),161.5(C-4),196.9(C-7),26.9(C-8),100.2(C-1′),73.6(C-2′),77.6(C-3′),70.0(C-4′),77.0(C-5′),61.0(C-6′)。波谱数据与文献[20]报道的数据一致,故鉴定化合物为云杉素。

FT-5:白色粉末(水),UV λ max: 258,292 nm;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz) δ : 7.33(1H,d,J=2 Hz,H-2),7.29(1H,dd,J=2.0,8.4 Hz,H-6),6.78(1H,d,J=8.4 Hz,H-5);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz) δ : 121.5(C-1),117.1(C-2),145.3(C-3),150.4(C-4),115.6(C-5),122.2(C-6),167.9(C-7)。波谱数据与文献[21]报道的数据一致,故鉴定化合物为原儿茶酸。

3 结论

本文以芳香新塔花为研究对象,通过双柱交替循环制备色谱,并对流动相进行直接再循环,对芳香新塔花组分进行分离纯化,得到5个单体化合物,经分析其纯度均达到96%以上。构建的方法具有节省溶剂、分离效率高等优点,用常规的分离方法不能分离或者很难分离的化合物可以利用本文方法得到很好的分离。因此,交替循环和直接循环液相色谱相结合的方法对天然产物复杂化合物的分离纯化具有较强的实用意义。

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