氧化石墨烯水溶液(GO)(2 mg/mL,由中国科学院山西煤炭化学研究所提供); WGA、ConA(美国Vector Labs公司);核糖核酸酶B(bovine pancreatic ribonuclease B,RNase B,17 kDa)、牛胎球白蛋白(bovine fetuin,fetuin,48.4 kDa)、鸡卵清白蛋白(albumin from chicken egg white,OVA,44.3 kDa)、牛晶体蛋白(the A chain of bovine lens α -crystallin,α -crystallin,19.79 kDa)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,66.43 kDa)、甲基- α -D-吡喃甘露糖苷(methyl- α -D-mannopyranoside)、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl- β -D-glucosamine)、 α -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)、1,4-二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、乙腈(ACN)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)(美国Sigma公司); pH 7.4 PBS缓冲液(美国Life Technologies公司);胰蛋白酶(trypsin)(美国Promega公司); PNGase F酶(美国New England Biolabs公司);碳酸氢铵、浓盐酸、氢氧化钠、氯乙酸钠(ClCH₂COONa)、Tris-HCl(pH 7.3)、氯化锰(MnCl₂)、氯化镁(MgCl₂)、氯化钙(CaCl₂)、氯化钠(NaCl)、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)(北京化学试剂公司);实验用水由Milli-Q纯水系统提供(美国Millipore公司)。

4800基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF-TOF MS,美国AB SCIEX公司);真空冰冻干燥机SC100A Speedvac Plus (美国Thermo Savant公司); Sartorius BP211d分析天平(德国Sartorius公司); 3K30型高速离心机(美国Sigma公司); NanoDrop 2000c超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司); Thermo Orion Model 818型pH计(美国Thermo公司),十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)跑胶系统(美国GE Healthcare公司)。

取1 mL氧化石墨烯水溶液(2 mg/mL),以 15000 g离心15 min,弃去上清液,加入200 μ L水重悬,将25 mg NaOH和25 mg氯乙酸钠溶于800 μ L水中并加入上述重悬的石墨烯水溶液中,涡旋混匀,冰浴超声15 min,将产物离心,弃去上清液,接着用1 mL水洗去多余的NaOH和氯乙酸钠,重复洗3次。

将上述处理好的GO加入到溶有400 mmol/L EDC、100 mmol/L NHS的1 mL pH 5.2 MES缓冲液中活化10 min,接着用pH 7.4 PBS缓冲液清洗3次,以去除多余的NHS和EDC。将4 mg WGA或者ConA溶于1 mL pH 7.4 PBS缓冲液中并加入到上述处理好的GO中,并在4 ℃下旋转反应过夜。将反应液以 14000 g离心10 min,取上清液,NanoDrop 2000c超微量分光光度计定量,考察凝集素负载量,沉淀用pH 7.4 PBS缓冲液清洗3次,于4 ℃下贮存备用。

氧化石墨烯固定化凝集素GO-WGA和GO-ConA使用之前用结合缓冲液(binding buffer,20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4),500 mmol/L NaCl,1 mmol/L MnCl₂,1 mmol/L CaCl₂,1 mmol/L MgCl₂)洗两遍。含有不同糖型的标准糖蛋白包括RNase B、牛胎球白蛋白、OVA和牛晶体蛋白。分别取标准糖蛋白(10 μ g)和BSA，按照1 ∶ 0、1 ∶ 10的质量比混合后,与合成的两种类型的GO-lectin各1 mg混合在500 μ L的结合缓冲液体系中，4 ℃下旋转反应过夜。之后,使用500 μ L的结合缓冲液清洗4次,以除去非特异性吸附的蛋白质,接着用300 μ L洗脱液(ConA: 200 mmol/L 甲基 α -D-吡喃甘露糖苷;WGA: 300 mmol/L N-乙酰- β -D-氨基葡萄糖)洗脱两次,合并洗脱液,透析除盐,冻干备用。冻干的样品用SDS-PAGE考察富集效果。

取标准蛋白牛胎球白蛋白、BSA各100 μ g分别溶于100 μ L的50 mmol/L NH₄HCO₃中,加入终浓度为10 mmol/L 的DTT,95 ℃水浴加热10 min后,取出冷却至室温,加入终浓度为50 mmol/L 的IAA,暗处室温反应45 min,按照蛋白质 ∶ 胰蛋白酶=50 ∶ 1(质量比)的比例分别加入2 μ g的胰蛋白酶,37 ℃水浴12 h,脱盐冻干后分别用100 μ L结合缓冲液重溶,其中1:取10 μ L的牛胎球白蛋白酶切肽段加入到100 μ L的BSA酶切物中充分混合(牛胎球白蛋白 ∶ BSA=1 ∶ 10,质量比); 2:取10 μ L的牛胎球白蛋白酶切肽段加入到100 μ L的结合缓冲液中(牛胎球白蛋白 ∶ BSA=1 ∶ 0,质量比)。将样品1、2分别加入到两管各1 mg已活化好的GO-WGA中,按照上述富集蛋白质的方法步骤富集洗脱以后,脱盐冻干,分别重溶于10 μ L的50 mmol/L NH₄HCO₃中,各加入1 U的PNGase F酶,于37 ℃水浴酶切12 h。然后进行MALDI-TOF质谱鉴定,鉴定条件同文献^[18]的2.8节。

GO-ConA和GO-WGA固定化凝集素的制备过程如图1所示:将GO用氯乙酸钠和氢氧化钠处理后,使GO表面上的环氧基开环生成羧基,提高了GO表面羧基的含量,为下一步凝集素的固定提供了大量的结合位点,以提高凝集素的负载量。接着使用NHS和EDC对GO上的羧基进行活化,以提高偶联反应效率,最后将凝集素ConA和WGA加入体系中,通过羧基与凝集素的自由氨基的偶联反应将其键合在GO的表面,得到富集糖蛋白、糖肽所需的GO-ConA和GO-WGA固定化凝集素。

图1

Fig. 1

图1 GO-lectin的制备流程图 Fig.1 Schematic diagram of preparation of the GO-lectin

GO是一种在每一层的石墨烯单片上都引入了大量的氧基功能团(如羧基、环氧基、羰基等)的层状结构材料,具有良好的亲水性,可以很好地分散在水溶液中,同时可以很容易地通过高速离心实现分离。如图2所示,通过透射电镜(TEM)对GO-ConA和GO-WGA的材料表面进行表征,可以看到相比GO而言,GO-ConA和GO-WGA的表面出现大量均匀的颗粒状结构,为WGA和ConA在GO表面的固定所致。

图2

Fig. 2

图 2 TEM表征GO和GO-lectin Fig.2 Transmission electron microscopic (TEM) images of GO and GO-lectin

为进一步考察凝集素在氧化石墨烯表面是否固定成功,我们对固定前后的氧化石墨烯进行了氮元素的X射线光电子能谱(XPS)分析。如图3所示,在399.9 eV处,GO无明显的氮元素吸收峰,而凝集素修饰的GO-ConA和GO-WGA则出现了明显的氮元素吸收峰,可归结于来自凝集素中的氨基酸,因此证明凝集素已成功键合到GO表面。通过测定固定前后溶液中凝集素的浓度变化,可以计算得到GO表面的凝集素固载量。分别将3次测试结果(GO-ConA: 2.058 mg/mg、2.097 mg/mg、2.064 mg/mg; GO-WGA: 1.907 mg/mg、1.911 mg/mg、1.906 mg/mg)取平均值得到GO表面的凝集素负载量为:GO-ConA 2.073 mg/mg,RSD=1.0% ; GO-WGA 1.908 mg/mg,RSD=0.14% 。该结果明显高于文献^{[17, 18]}中使用微米或纳米颗粒作为基质材料所获得的凝集素固载量。

图3

Fig. 3

图 3 XPS检测GO和GO-lectin上的N元素 Fig.3 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectra of GO and GO-lectin

上述结果充分表明在本实验中,按照以上条件,我们成功地在GO表面实现了高负载量的凝集素ConA和WGA的固定。

为了考察我们合成的GO-ConA和GO-WGA固定化凝集素对糖蛋白的富集效果、选择性和重复使用的稳定性,我们以几种标准糖蛋白及其与非糖蛋白BSA的混合物为样本,通过SDS-PAGE进行验证。因为ConA与甘露糖具有特异性亲和作用,WGA与N-乙酰葡糖糖胺具有特异性亲和作用,所以在标准糖蛋白的富集实验中,我们使用GO-ConA富集带有甘露糖糖链的RNase B和OVA,使用GO-WGA富集带有N-乙酰葡糖糖胺结构的牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白。为了进一步考察所合成的GO-lectin材料对糖肽的富集效果,我们使用GO-WGA对牛胎球白蛋白和BSA的酶解肽段混合物进行富集,并用MALDI-TOF MS对富集产物进行鉴定。

图4是在没有非糖蛋白BSA干扰的情况下,分别使用GO-ConA或GO-WGA对标准糖蛋白的富集效果考察。可以看出在1、3、5、7泳道中,富集后的上清液中几乎无残留的标准糖蛋白对应的条带;而在2、4、6、8泳道中,洗脱液中出现了明显的标准糖蛋白对应的条带。说明GO-ConA和GO-WGA具有较高的富集效率,对标准糖蛋白可实现完全富集。图5是以标准糖蛋白与非糖蛋白BSA的混合物(糖蛋白 ∶ BSA=1 ∶ 50,质量比)为样本的富集选择性评价。可以看出在1、3、5、7泳道中,上清液只能看到BSA对应的条带,而几乎无糖蛋白残留。而在2、4、6、8泳道中,洗脱液中只有糖蛋白对应的条带,几乎无BSA的条带。在此基础上,我们以RNase B、OVA、牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白4种糖蛋白的混合物为样本,对存在其他糖类物质/糖型干扰的情况下GO-lectin的富集选择性进行了进一步考察。图6是4种糖蛋白按1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1的质量比混合后为样本的GO-lectin富集选择性评价。1、2泳道分别对应GO-WGA富集后的上清液和洗脱液,3、4泳道分别对应GO-ConA富集后的上清液和洗脱液。根据相对分子质量的判断,可以发现在1泳道中的上清液中只能看到RNase B和OVA,而在泳道2中的洗脱液中只能看到牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白;3泳道中的上清液中只能看到牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白,而在泳道4中的洗脱液中只能看到RNase B和OVA。说明GO-ConA对带有高甘露糖型的RNase B和OVA的高效、高选择性富集能力不会受到带有N-乙酰氨基葡萄糖的牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白的干扰,GO-WGA对带有N-乙酰氨基葡萄糖的牛胎球白蛋白和牛晶体蛋白的高效、高选择性富集能力不会受到带有高甘露糖型的RNase B和OVA的干扰。以上数据说明GO-lectin对糖蛋白具有良好的富集选择性,不受非糖蛋白和其他糖蛋白的干扰,即便存在50倍过量的非糖蛋白干扰,仍可获得良好的富集效果。

图4

Fig. 4

图 4 GO-ConA和GO-WGA在无BSA干扰的情况下富集标准糖蛋白的SDS-PAGE表征图 Fig.4 SDS-PAGE picture of α -crystallin,fetuin,OVA and RNase B after GO-lectin enrichment without BSA interference Lane 1: supernatant of α -crystallin after enrichment; Lane 2: eluent of α -crystallin after enrichment; Lane 3: supernatant of fetuin after enrichment; Lane 4: eluent of fetuin after enrichment; Lane 5: supernatant of OVA after enrichment; Lane 6: eluent of OVA after enrichment; Lane 7: supernatant of RNase B after enrichment; Lane 8: eluent of RNase B after enrichment. Lane M: relative molecular mass standards.

图5

Fig. 5

图 5 GO-ConA和GO-WGA富集标准糖蛋白的SDS-PAGE图(糖蛋白 ∶ BSA=1 ∶ 50,质量比) Fig.5 SDS-PAGE picture of α -crystallin,fetuin,OVA and RNase B after GO-lectin enrichment (glycoprotein ∶ BSA=1 ∶ 50,w/w) Lane 1: supernatant of α -crystallin after enrichment; Lane 2: eluent of α -crystallin after enrichment; Lane 3: supernatant of fetuin after enrichment; Lane 4: eluent of fetuin after enrichment; Lane 5: supernatant of OVA after enrichment; Lane 6: eluent of OVA after enrichment; Lane 7: supernatant of RNase B after enrichment; Lane 8: eluent of RNase B after enrichment. Lane M: relative molecular mass standards.

图6

Fig. 6

图 6 GO-lectin固定化凝集素富集4种标准糖蛋白混合物的SDS-PAGE图 Fig.6 SDS-PAGE picture of a mixture of α -crystallin, fetuin,OVA and RNase B after GO-lectin enrichment Lane 1: supernatant after enrichment by GO-WGA; Lane 2: eluent after enrichment by GO-WGA; Lane 3: supernatant after enrichment by GO-ConA; Lane 4: eluent after enrichment by GO-ConA; Lane M: relative molecular mass standards.

图7是每隔3天测一次同一GO-lectin材料对对应糖蛋白的富集效果,可以看出材料合成两周内富集效果都＞200 μ g/mg。图8是糖蛋白牛胎球白蛋白和非糖蛋白BSA(1 ∶ 10,质量比)的酶解肽段混合物在GO-WGA富集前、后的MALDI-TOF质谱鉴定结果。

图7

Fig. 7

图 7 GO-lectin重复使用的稳定性考察 Fig.7 Stability of GO-lectin in repeated glycoprotein enrichment experiments

图8

Fig. 8

图 8 牛胎球白蛋白 ∶ BSA=1 ∶ 10(质量比)的酶解肽段 混合物经GO-WGA(a)富集前、(b)富集后的MALDI-TOF MS图 Fig.8 MALDI-TOF MS spectra of the de-glycosylated N-glycopeptides from mixture of fetuin and BSA (1 ∶ 10,w/w) (a) before and (b) after enrichment by GO-WGA

从图8中可以看出,在富集前,谱图中的大量BSA非糖肽信号将牛胎球白蛋白的糖肽信号严重抑制,难以鉴定。而经GO-WGA富集后,绝大部分非糖肽被去除,在谱图中可以清楚地鉴定到牛胎球白蛋白全部3条糖肽 (LCPDCPLLAPLN*DSR 1741 Da; VVHAVEVALATFNAESN*GSYLQLVEISR 3017 Da; RPTGEVYDIEIDTLETTCHVLDPTPLAN*CSVR 3673 Da)。 以上数据说明,即便是在存在大量非糖肽干扰的情况下,GO-lectin仍可以实现高选择性、高效的糖肽富集。我们将这一特性归结于GO-lectin的超大比表面积及高官能团密度所导致的超高凝集素负载量。GO表面高密度的凝集素修饰不但能够有效捕获低丰度的糖蛋白和糖肽,而且有助于多个凝集素分子与糖链形成多价结合,从而增强二者间的亲和性,进一步提高富集效率^{[22, 23]}。