因回归模型是关于因变量与自变量回归关系的一个函数,色谱优化指标是由多个基本指标组成的另一个函数,故利用色谱优化指标建立的回归模型采用常规求解方法难以实现最优化。若要实现试验结果的最优化,必须先在预测区间内对回归模型求解,再对色谱优化指标中的基本指标分别进行筛选优化,最终获得最优方案。故通过编程软件设计了针对综合性优化指标(以HCRF为例)的智能筛选程序(见图1),其基本原理为:首先,选择合适的自变量预测区间,利用回归模型求出所有解,并建立一个包含所有解的矩阵 Z ;其次,将矩阵 Z 分割为3个分别关于出峰数目n、最难分离物质对分离度R_min和最后流出组分保留时间T的新矩阵 Z₁、 Z₂和 Z₃;然后,利用筛选条件1(n)、2(R)和3(T)分别对3个新矩阵进行筛选得到初选结果,再利用筛选条件4(梯度时间，t_G，min)对初筛结果进一步筛选得到终选结果;最后,通过HPLC实验验证,n、R_min、T和信噪比(S/N)等信息,筛选出出峰完全、分离度好、灵敏度高且分析时间短的最佳色谱条件。

图1

Fig. 1

图1 回归正交评价指标智能筛选流程图 Fig.1 Flowchart of regression index filter method

色谱分离条件的优化目的即是要在保证分离度和灵敏度的前提下实现快速分析^[22],可见最优的色谱分离条件必须同时考虑出峰数目、分离度、灵敏度和分析时间4个因素。

出峰数目即所有待测目标化合物的总个数(如:测定16种多环芳烃,n=16)。而分离度通常选择R=1.5作为相邻两峰完全分离的标准^[23],当R=1.0时基本达到分离,分离效果98.0% ; R=1.5时达到全分离(基线分离),分离效果99.7% ; R=2.0时实现充分完全分离,分离效果99.9% 。同时为缩短分析时间可将分离度控制在1.5＜R_min＜2.0。

分析时间的选择原则是在保证待测组分完全分离且所有组分都流出色谱柱的前提下,分析时间越短越好。一般情况下,不同项目的分析时间可以通过前期实验摸索或查阅相关文献做参考,而复杂样品为取得较好的分离效果就需要采用梯度洗脱或程序升温进行分离。此时,可以通过计算梯度时间或组分保留时间来选择恰当的分析时间。通常高效液相色谱法分析一个复杂样品的时间为15～30 min^[24],而气相色谱法由于气体迁移速率高,分析速度快,一般几分钟可完成一个分析周期^[19]。

梯度时间的计算公式如下^{[25, 26]}:

组分保留时间计算公式如下^[19]:

对于灵敏度,在分析测试方法研究中主要使用信噪比、检出限或定量限来评价。其中信噪比是其评价的核心指标,因为检出限和定量限通常用信噪比为2～3和10的量来定义^[27]。因此,在其他指标都达到分析要求的情况下,应尽量选择灵敏度较高的色谱分离条件作为最佳色谱条件，即回归模型的最优解。

回归正交试验影响因素及因素水平编码 以梯度初始浓度x₁、梯度初始斜率x₂、梯度初始时间x₃为考察因素,每个因素设计2个水平(见表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 回归正交试验影响因素及因素水平取值 Table 1 Influence factors and levels of orthogonal regression design Line Factors x1/% x2/(%/min) x3/min 1 50 0.5 5.0 2 70 1.5 10.0

表1 回归正交试验影响因素及因素水平取值 Table 1 Influence factors and levels of orthogonal regression design

将因素x_j的各水平进行线性变换即^[21]：

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 因素水平编码表 Table 2 Factor level coding table Coding Factors x1/% x2/(%/min) x3/min Upper level (1) 70 1.5 10.0 Lower level (-1) 50 0.5 5.0 Zero level (0) 60 1.0 7.5 Spacing Δ j 10 0.5 2.5

表2 因素水平编码表 Table 2 Factor level coding table

回归正交试验表头设计 试验除了考察x₁、x₂、x₃的主效应外,还考察x₁与x₂、x₁与x₃、x₂与x₃的二级交互作用。由各项自由度之和为6,选用L₈(2⁷)来进行实验设计：首先，将主效应x₁、x₂、x₃分别安排在第1、2和4列(即z₁、z₂、z₃安排在第1、2和4列上)；其次，将交互作用x₁x₂、x₁x₃、x₂x₃(即z₁z₂、z₁z₃和z₂z₃)分别安排在第3、5和6列上；然后，将剩下的一个空列7作为误差列；最后，每号试验的方案由z₁、z₂、z₃对应的水平确定。

试验确定以梯度初始浓度x₁为40% ～80%和梯度初始时间x₃为0～40 min作为预测范围,包含的所有解个数为 1 681 个(见图2);筛选条件1为n=16;筛选条件2为1.5≤R_min≤2.0;期望分析时间T为15～25 min,即筛选条件3为15≤T≤25 min;筛选条件4为t_G≤T(t_G由公式(6)计算)。最优解智能筛选程序根据上述原理及条件,利用MATLAB软件编写而成。

图2

Fig. 2

图2 所有解的三维曲面图 Fig.2 All solutions of 3-D surface graph

将16种多环芳烃混合标准溶液准确配制成100 μ g/L(以蒽为例)的标准溶液,流速1.5 mL/min、柱温30 ℃、紫外波长254 nm,取15.00 μ L注入高效液相色谱仪,按试验安排进行实验。

采用“Enter”法引入6个自变量,建立了2个回归模型即模型1(z₁z₃,z₃,z₁)和模型2(z₂z₃,z₁z₂,z₂)。从表4可以看出,回归模型1和2的相关系数R分别为0.996和0.999,判定系数R²分别为0.993和0.998。R²接近1说明回归直线的拟合度高且两个回归模型的拟合优度较好。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 回归模型的拟合度检验结果 Table 4 Goodness of fit test of regression model Model R R square(R2) Adjusted R square Std. error of the estimate 1 0.9961) 0.993 0.987 520.836018 2 0.9992) 0.998 0.986 530.437920 1) Predictors: (constant),z1z3,z3,z1; 2) predictors: (constant),z1z3,z3,z1,z2z3,z1z2,z2.

表4 回归模型的拟合度检验结果 Table 4 Goodness of fit test of regression model

由方差分析结果(见表5)可知,模型1的F值为177.488,Sig.=0.000(＜0.001),表明模型1回归极显著且回归效果好;模型2的F值为86.036,Sig.=0.082(＞0.05),表明回归效果较差。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 回归模型的方差分析表1) Table 5 Analysis of variance regression model1) Model Parameter Sum of squares df Mean square F Sig. 1 regression 1.444×108 3 48147238.64 177.488 0.0002) residual 1.085×106 4 271270.16 total 1.455×108 7 2 regression 1.452×108 6 24207572.03 86.036 0.0823) residual 2.814×105 1 281364.39 total 1.455×108 7 1) Dependent variable: HCRF; 2) predictors: (constant),z1z3,z3,z1; 3) Predictors: (constant),z1z3,z3,z1,z2z3,z1z2,z2.

表5 回归模型的方差分析表1) Table 5 Analysis of variance regression model1)

由t检验结果(见表6)可知,模型1的Sig.=0.000(＜0.001),表明该模型具有显著回归意义;模型2的Sig.＞0.01,且存在3个不具回归意义的自变量(z₂、z₁z₂和z₂z₃),表明该模型回归意义不显著;由容差和VIF值可知各自变量之间的共线性弱。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 偏回归系数和t检验结果1) Table 6 Results of the partial regression coefficients and t test1) Model Parameter Unstandardized coefficients Standardized coefficient(Beta) t Sig. Collinearity statistics B Std. error Tolerance VIF 1 (constant) 1618768.413 1365.644 1185.352 0.000 z1 -313.648 18.414 -0.735 -17.033 0.000 1 1 z3 764.153 73.657 0.448 10.374 0.000 1 1 z1z3 4274.653 368.287 0.501 11.607 0.000 1 1 2 (constant) 1617868.384 1645.640 983.124 0.001 z1 -313.648 18.754 -0.735 -16.724 0.038 1 1 z3 764.153 75.015 0.448 10.187 0.062 1 1 z1z3 4274.653 375.076 0.501 11.397 0.056 1 1 z2 75.577 375.076 0.009 0.201 0.873 1 1 z1z2 624.887 375.076 0.073 1.666 0.344 1 1 z2z3 -75.252 375.076 -0.009 -0.201 0.874 1 1 1) Dependent variable: HCRF.

表6 偏回归系数和t检验结果1) Table 6 Results of the partial regression coefficients and t test1)

结合上述检验结果,选取拟合度高、显著性明显的模型1建立一次回归数学模型:

根据编码公式z₁=(x₁-60)/10和z₃=(x₃-7.5)/2.5,将上述回归方程进行回代并整理得: