色谱  2015, Vol. 33 Issue (2): 174-181   PDF (1993 KB)    
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程权
杨方
李捷
卢声宇
蓝锦昌
江锦彬
顶空固相微萃取-全二维气相色谱/飞行时间质谱法分析闽南乌龙茶中的挥发性成分及其在分类中的应用
程权2, 杨方1 , 李捷1, 卢声宇1, 蓝锦昌1, 江锦彬1    
1. 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 福建省检验检疫重点实验室, 福建 福州 350001;2. 食品安全 分析与检测教育部重点实验室, 福建省食品安全分析与检测重点实验室, 福州大学化学系, 福建 福州 350108
收稿日期：2014-09-25
基金项目：国家质检总局科研项目(2013IK147);福建省科技重点项目(2012Y6001).
通讯作者：杨方,E-mail:yffjciq@gmail.com.
摘要：采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合全二维气相色谱/飞行时间质谱(GC×GC-TOF MS)分析了闽南乌龙茶中的挥发性成分。从48份不同等级和产季的乌龙茶(铁观音、黄金桂、本山、毛蟹和梅占)中获得了2000余种挥发性化合物,经筛选得到51种共有组分,并结合质谱数据库、保留指数与结构谱图等进行了初步鉴定。在此基础上采用主成分分析法(PCA)获得得分投影图,直观给出了不同样品的分类趋势。通过逐步判别获得9种对分类结果有显著影响的组分,并以此为变量通过Fisher判别法(FDA)建立了4个判别函数,对样品的分类准确率达到97.9%。本试验证实了以挥发性成分识别闽南乌龙茶的可行性。
关键词： 顶空固相微萃取     全二维气相色谱/飞行时间质谱     主成分分析     Fisher判别分析     挥发性成分     闽南乌龙茶    
Analysis of the volatile components in Minnan oolong tea by headspace solid phase microextraction coupled with comprehensive two-dimensional gas chromatography- time of flight mass spectrometry and the application in its variety identification
CHENG Quan2, YANG Fang1 , LI Jie1, LU Shengyu1, LAN Jinchang1, JIANG Jinbin1    
1. Inspection and Quarantine Technical Center of Fujian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Key Laboratory of Inspection and Quarantine of Fujian, Fuzhou 350001, China;2. Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety of Ministry of Education, Fujian Provincial Key Laboratory of Analysis and Detection Technology for Food Safety, Department of Chemistry of Fuzhou University, Fuzhou 350108, China
Received: 2014-09-25
Abstract: A method to analyze the volatile components in Minnan oolong tea was developed based on headspace solid phase microextraction (HS-SPME) coupled with comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry (GC×GC-TOF MS). Volatile compounds of 48 oolong tea samples with different qualities and production seasons from five varieties (Tieguanyin, Huangjingui, Benshan, Maoxie and Meizhan) were extracted by HS-SPME and analyzed by GC×GC-TOF MS. More than 2000 peaks were obtained from each sample, and 51 common compounds were tentatively identified by comparison with the standard mass spectrum databases, retention indices and structure spectra. The projection score of the common compounds obtained from principal component analysis (PCA) had presented a straightforward classification trend for different oolong tea varieties. In addition, 9 compounds which had significant impact on the classification were selected by stepwise discriminate analysis, and used as variables to establish four discriminated functions by Fisher's discriminate analysis (FDA). The accuracy for the recognition of 48 samples was 97.9%. The results had demonstrated the feasibility of the method to be used to discriminate the oolong tea varieties.
Key words: headspace solid phase microextraction (HS-SPME)     comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry (GC×GC-TOF MS)     principal component analysis (PCA)     Fisher's discriminate analysis     volatile components     Minnan oolong tea    

茶是全球消费量最大的饮料[1]。茶的品种丰富,分类方法多样,一般根据茶的发酵程度可以分为三类:不发酵的绿茶、半发酵的乌龙茶及发酵的红茶[2],其中乌龙茶为我国特有茶种。乌龙茶主要产地包括福建的闽南安溪产茶区、福建的闽北武夷山产茶区、广东东部及北部产茶区和台湾玉山产茶区,其中以闽南乌龙茶产量最高。闽南乌龙茶主要品种有铁观音、黄金桂、本山、毛蟹、梅占等。不同品种的茶叶品质与价格相差较多,如闽南乌龙茶中最具代表性的铁观音,其茶树生长缓慢、单产低,但市场需求大,价格昂贵,市场上常见以产量大、价格低的本山冒充铁观音欺诈消费者,一般感官较难区分。因此建立可靠的识别方法具有现实意义。

目前,利用分析仪器测定茶叶的相关信息,结合化学计量学方法进行识别与分类,已经成为分析化学中茶叶识别与分类研究的主要模式[3, 4, 5]。用于表征茶叶种类的物质很多,如茶多酚、黄酮类化合物、氨基酸、矿物质等。但茶叶的香气是决定茶叶品质和风味的关键因素,因此有文献报道以茶叶中挥发性成分对茶叶品种进行鉴别[6, 7]。近10年来发展完善的全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF MS)分析技术,利用特殊的二维正交柱系统进行分离,利用飞行时间质谱定性识别化合物的结构信息,具有灵敏度高、峰容量大、分析快速等特点,已被应用于食品(包括茶叶)的掺假识别与成分分析[8, 9, 10, 11, 12]。本文在前人研究基础上,以GC×GC-TOF MS技术结合主成分分析法(PCA)和Fisher判别法(FDA)对5种闽南乌龙茶中的挥发性成分进行分析,成功区分了产自福建省安溪县不同季节与品质的乌龙茶。本研究对识别茶叶品种、判别茶叶掺假具有一定的参考价值。

1 实验部分
1.1 仪器与材料

PEGASUS 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪(美国LECO公司),带有ChromaTOF软件;Agilent 7890A气相色谱仪(美国安捷伦公司);固相微萃取装置(美国Supelco公司),含操作台、手柄、50/30 μ m固相微萃取头,涂层为二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲硅氧烷共聚物(DVB/CAR/PDMS)(美国Supelco公司)。

1.2 实验样品

茶叶样品采自福建省安溪县,其中铁观音样品14个、黄金桂样品8个、本山样品9个、毛蟹样品10个、梅占样品7个。所有样品均未经拼配。为了增强样品的代表性,每个样品的生产时间和品质等级均不同。所有样品研磨成粉后过40目筛,置于4 ℃冰箱中储存备用。

1.3 样品前处理

本实验采用顶空固相微萃取(HS-SPME)方法提取茶中挥发性成分。将固相微萃取头置于气相色谱进样口于250 ℃下老化30 min。称取约2 g样品于250 mL顶空瓶中,封口后置于80 ℃水浴中10 min,然后插入固相微萃取头提取1 h后取出进样。进样口脱附时间为2 min。同时在相同条件下制备空白对照样品。

1.4 仪器条件设置

气相色谱:正交二维柱系统由TG-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m)与DB-17HT高温气相色谱柱(10 m×0.1 mm×0.2 μ m)两部分组成;TG-5MS色谱柱载气为氦气,流速2 mL/min;分流比10 ∶ 1;进样口温度250 ℃;柱温升温程序:初始温度50 ℃,保持2 min,以5 ℃/min 升至250 ℃,保持10 min。第二维色谱柱为DB-17HT高温气相色谱柱,选择比第一维色谱柱高5 ℃的初始温度同步升温。

飞行时间质谱:电子轰击电离源(EI),电离电压70 eV;溶剂延迟时间3 min;离子源温度220 ℃;传输线温度250 ℃;全扫描监测,扫描范围35～500 u;扫描速率50 u/s;监测电压 1600 V。

1.5 实验数据处理

利用仪器自带的ChromaTOF软件对数据进行初步处理。一维与二维色谱峰的峰宽分别设为20 s和0.4 s,根据NIST质谱数据库得到化合物信息(化合物名称、一维与二维色谱峰的保留时间、相似度、峰面积与相对峰面积等信息)。扣除杂质、柱流失等干扰后选择5类样品的共有化合物,以化合物的相对峰面积建立数据矩阵,通过PCA与FDA两种化学计量学方法对数据矩阵进行分析。本文数据分析借助IBM SPSS Statistics 19软件完成。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化

茶叶的品质主要是由其内在的化学成分和冲泡过程中所表现出来的感官性状决定的,其中呈香的挥发性芳香成分是决定茶叶品质的重要因素之一。茶叶所具有的香气是其所含众多芳香类物质综合表现的结果,与茶叶的种植、采摘、加工及储存等条件密不可分[13]。传统的一维气相色谱分离能力有限,得到的谱峰信息较难充分表征不同茶叶的特色。二维气相色谱由两根不同极性的色谱柱组成二维正交柱系统,大大提高了峰容量,使复杂化合物的分离分析成为可能。本文色谱分离系统的第一维选用弱极性色谱柱,固定相为5%苯基-95%甲基聚硅氧烷聚合物。第二维选用中等极性色谱柱,固定相为50%苯基-50%甲基聚硅氧烷聚合物,柱长与膜厚均比第一维色谱柱小很多。适当优化柱温升温程序和调制 器的调制周期,使样品先根据沸点的差异在第一维 色谱柱上得到分离,分离后的化合物采用调制器以脉冲的方式进入第二维中等极性色谱柱中,根据极性进一步分离。短周期的脉冲模式确保了第一维柱的高分辨率与第二维柱的窄峰宽,在提高分离速度的同时避免两次脉冲信号的交叉或重叠。

2.2 数据筛选

图1是5种乌龙茶的典型等高线色谱图。5种乌龙茶香气组分的色谱图较为相似,很难从图中找出代表性的特征物质。每个乌龙茶样本的谱图均包 括 2000 多个色谱峰,采用ChromaTOF软件按以下标准进行筛选:化合物定性相对明确且谱库检索相似度大于800、平均相对峰面积大于0.1%选择各类样品的共有组分。表1为按此条件筛选得到的51种化合物。

图1 5种乌龙茶样品的等高线色谱图 Fig.1 2D contour plots of the five oolong tea samples

表1 乌龙茶样品挥发性成分中的共有化合物 Table 1 Common volatile compounds in oolong tea samples

由表1可见,5种闽南乌龙茶中共有的挥发性组分包括脂肪族化合物2-己烯醛、辛醛、戊酸,脂环类化合物紫罗酮,萜烯类化合物如橙花叔醇、四氢-6-(2-戊烯基)-2H-吡喃-2-酮等,芳香族化合物如苯甲醛、苯甲醇、顺式-3-己烯醇苯甲酸酯、异丁酸苯乙酯等,含氮、氧、硫等杂环类化合物如5H-1-氮茚、四氢呋喃、2-戊基呋喃、苯并噻唑等,以及其他一些茶叶特有的化合物如咖啡因、植醇等。这些挥发性物质在以往的文献中曾有报道[13],这些化合物与其他一些物质之间的比例及协调平衡,构成了不同茶叶独特的感官性质。由于这些物质非某种茶叶所特有,因而单纯依靠分析这些成分识别茶叶品种存在一定困难。

2.3 主成分分析

本文分别考察了常用的PCA与FDA两种常用的化学计量学方法的分析效果。表2为主成分分析中前10个主成分的方差贡献率,可以看出10个主成分累积贡献率不足80% 。由于过多的特征量会给随后的计算带来困难,本文选择前3个主要特征值进行分析,累积方差贡献率约44% 。图2为5种乌龙茶样品在这3个主要特征值上的得分投影图。由图2可见,5种乌龙茶虽然呈现出一定程度的分散,但较混乱,说明尽管这些特征值包括了乌龙茶样品的信息,但并不突出,难以表征不同茶叶的特点,采用该法分析存在缺陷。

表 2 主成分分析法中10个主成分的方差贡献率 Table 2 Variance contribution rates of the ten principal components in principal component analysis (PCA)

图2 5种乌龙茶样品的主成分得分投影图 Fig.2 Projection score plots of oolong tea samples obtained by principal component analysis
2.4 Fisher判别分析
2.4.1 建立Fisher判别函数

本文采用Wilks’ lambda逐步判别法筛选对分类结果有显著影响的组分,使用F值进行判别。所有的运算使用SPSS 19完成。当加入或剔除一个变量后,对判别函数中的变量进行方差分析,当计算的F值不小于系统默认的指定值3.84时,保留该变量;当计算的F值不大于系统默认的指定值2.71时,则将该变量从函数中剔除。最终9个主成分的F值符合变量选入函数标准的要求,作为建立判别函数的变量(见表3)。

表 3 Fisher判别函数 Table 3 Fisher’s discriminate functions

由9个变量组成的4个判别函数的特征值及方差贡献率见表4。表5为针对这4个判别函数进行的有效性检验。Wilks’ lambda表示组内离差交叉乘积矩阵行列式与总离差交叉矩阵行列式的比值,其值越小表示判别能力越强。由表5可见,前3个差别函数与4联合的显著性水平均为0.000,说明前3个判别函数的判别能力是显著的。

表 4 判别函数及5种乌龙茶在判别函数下的重心坐标 Table 4 Discriminate functions and the coordinates of the center of gravity of the oolong tea samples

表 5 判别函数的有效性检验 Table 5 Effectiveness test of discriminate functions
2.4.2 判别效果的检验

为直观表示组内聚类情况和组间距离大小,以样品在前3个判别函数上的得分绘制三维散点图(图3)。由图3可见,5种乌龙茶样品各自分布相对集中,可以清楚地进行识别。

图 3 乌龙茶样品经Fisher判别检验的得分投影图 Fig.3 Scatter plots of samples obtained by Fisher’s discriminate analysis (FDA)

将8个样品的相应变量带入4个判别函数,得到一个四维数据。将该四维数据作为该样品在四维空间中的坐标,计算与各类样品重心坐标的距离,以此作为分类的依据。对48个样品进行分类,结果(见表6)表明,除23号样品外,其余47个样品均得到正确区分(A、B、C、D、E分别代表铁观音、黄金桂、本山、毛蟹和梅占乌龙茶样品)。说明这4个变量的选择对该5种乌龙茶的判别分析有效。

表 6 Fisher判别分析法的判别结果 Table 6 Classification results obtained by Fisher’s discriminate analysis
3 结论

本文采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱对不同种类的闽南乌龙茶中挥发性成分进行分离分析,通过筛选获得51个共有组分,并利用主成分分析法与Fisher判别分析法进行分析。结果表明,51个共有组分中包含了不同乌龙茶种类的特征信息,利用主成分分析法可以观测到不同种类乌龙茶的分类趋势。而Fisher判别分析法的识别效果更为准确,对48个不同种类的乌龙茶样品进行判别时仅出现一个误判,准确率达到97.9% ,且季节与品质的不同没有为实验结果带来干扰。结果表明,采用本文的研究方法对不同茶叶进行识别是可行的。

参考文献
[1]Seetohul L N, Islam M, Hare W, et al. J Sci Food Agric, 2006, 86: 2092  
[2]Tanaka T, Kouno I. Food Sci Technol Res, 2003, 9: 128  
[3]Cheng Q, Yang F, Wang D H, et al. Spectroscopy and Spectral Analysis (程权, 杨方, 王丹红, 等. 光谱学与光谱分析), 2014, 34(3): 656
[4]Huo D Q, Wu Y, Yang M, et al. Food Chem, 2014, 145: 639  
[5]Wang L F, Lee J Y, Chung J O, et al. Food Chem, 2008, 109: 196  
[6]Ye N S, Zhang L Q, Gu X X. Food Anal Methods, 2012, 5: 856  
[7]Lin J, Zhang P, Pan Z Q, et al. Food Chem, 2013, 141: 259  
[8]Zhao F, Liu J, Wang X, et al. Eur J Lipid Sci Technol, 2013, 115(3): 337  
[9]Vestner J, Malherbe S, Du Toit M, et al. J Agric Food Chem, 2011, 59(24): 12732  
[10]Villière A, Arvisenet G, Lethuaut L, et al. Food Chem, 2012, 131(4): 1561  
[11]Spanik I, Janacova A, Susterova Z, et al. Chem Pap, 2013, 67(2): 127  
[12]Zhang L, Zeng Z D, Ye G Z, et al. Chinese Journal of Chromatography (张磊, 曾仲大, 叶国柱, 等. 色谱), 2014, 32(8): 804
[13]Yuan H B, Yin J F, Ye G Z, et al. China Tea (袁海波, 尹军峰, 叶国柱, 等. 中国茶叶), 2009(9): 14