色谱  2015, Vol. 33 Issue (5): 535-540   PDF (776 KB)    
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戴朝政
超高效液相色谱塔板高度方程的推导
戴朝政     
中国科学院成都有机化学研究所, 四川 成都 610041
收稿日期：2014-10-20
通讯作者：戴朝政,E-mail:Daichaozheng@126.com.
摘要：近年来,分析工作者采用超高效液相色谱(UPLC)完成了许多过去不能完成的分离分析工作。但是在阐述UPLC原理时不少人却采用了van Deemter方程。这是不对的。本文研究了UPLC色谱过程动力学,从热传导方程出发运用色谱动力学原理推导了包括考虑流动相摩擦生热影响的UPLC塔板高度方程H=2γDm/u+((2λdpu1/3)/(u1/3+ω(Dm/dp)1/3))+((2ku)/((1+k)2(1+κ0)κd))+ ((θ(κ0+κ0k+k)2dp2u)/(Dmκ0(1+κ0)2(1+k)2)) +(κi(κ0+κ0k+k)2dp5/2u2/3)/(3κ0Ω Dm2/3(1+κ0)2(1+k)2+(r02(κ0+κκ0k+k)u)/(4(1+k)Dr)·exp(-Kr02α)。上述方程右端最后一项代表了流动相摩擦生热对塔板高度的贡献。当流动相线速度较低时,流动相摩擦生热对塔板高度的贡献趋近于零,塔板高度方程还原成Horvath和Lin的方程;当流动相线速度较高时,由于流动相摩擦生热,柱轴心与边缘温差增加,流动相线速度径向分布差异导致柱效率降低,而柱轴心与边缘的温差与流动相线速度平方成正比。作者明确指出:UPLC的柱效率与柱内径密切相关,采用细内径柱有利于实现高效率;过高的流动相线速度将导致柱效率崩溃。
关键词： 超高效液相色谱     色谱过程动力学     柱效率崩溃     塔板高度方程    
Deductive inference on the plate height equation of ultra performance liquid chromatography
DAI Chaozheng     
Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China
Received: 2014-10-20
Abstract: In recent years, separation and analysis workers have made considerable progress on ultra performance liquid chromatography (UPLC). A lot of separation works have been completed which have never been done before. But the theory about chromatographic dynamics of UPLC from the beginning up to now, is remaining in 1950's. Some people explain the principle of UPLC by the van Deemter equation, but this is not right. In this paper, the dynamic process of UPLC has been studied. According to the chromatographic dynamics principle and starting from the heat conduction equation, the plate height equation of UPLC including the influence of mobile phase friction heat production has been deduced as follows: H=2γDm/u+((2λdpu1/3)/(u1/3+ω(Dm/dp)1/3))+((2ku)/((1+k)2(1+κ0)κd))+ ((θ(κ0+κ0k+k)2dp2u)/(Dmκ0(1+κ0)2(1+k)2)) +(κi(κ0+κ0k+k)2dp5/2u2/3)/(3κ0Ω Dm2/3(1+κ0)2(1+k)2+(r02(κ0+κκ0k+k)u)/(4(1+k)Dr)exp(-Kr02α). The last item on the right represents the contribution of mobile phase friction heat. When the linear velocity of mobile phase is lower, the contribution of mobile phase friction heat tending to become zero, the plate height equation is reduced to the Horvath and Lin equation. When the linear velocity of mobile phase is high, the temperature difference between the column axial center and edge is directly proportional to the mobile phase linear speed square, and the contribution of thermal effect will largely increased. In this paper, the author clearly pointed out that the column efficiency of UPLC has a direct bearing on the column diameter. Using fine diameter column is helpful to implement column efficiency. Too high mobile phase velocity will lead to the column efficiency collapsed.
Key words: ultra performance liquid chromatography (UPLC)     chromatographic dynamics     column efficiency collapsed     plate height equation    

近年来,分析工作者采用超高效液相色谱(UPLC)完成了许多过去不能完成的分离分析工作[1, 2]。但是在阐述UPLC原理时不少人却采用了van Deemter方程。van Deemter方程是上个世纪50年代用来解释填充柱气相色谱塔板高度与各种因素关系的公式,用它解释UPLC过程动力学是不对的。因此有必要对UPLC的色谱过程动力学进行专门的研究。

与一般的HPLC不一样的是,UPLC采用的填料粒度细,因而UPLC的柱前压力特别高。流动相通过色谱柱时有摩擦力存在,有摩擦力就要做功,而所做的功最后全部转换成热能。在液相色谱过程中体现出来是色谱柱发热。按照能量转换守恒定律,一般的HPLC过程中在理想的绝热条件下，流动相通过色谱柱后的温度会升高大致0.7 ℃。因此在一般情况下流动相的温度升高对柱效率的影响感觉不到,可以忽略不计,但现在的UPLC柱前压提高到100～150 MPa,绝热条件下流动相的摩擦生热升温理论上可达3～4.5 ℃。这时温度的升高对柱效率的影响就不可不考虑了。

流动相在色谱过程中发出的热量在柱断面上是均匀的,由于柱边缘可以散热,其结果是柱中心的温度比柱断面边缘要高,形成一个温度梯度或称为温度场。一般情况下，溶液温度高时黏度低,故在柱中心流动相流速快。柱断面边缘流动相因温度低,流速相对要慢。由于温度的差异,组分在柱内不同位置的保留也有所不同,这两个因素最终导致色带的弥散,对柱效率产生不良的影响。

上世纪70年代,Horvath和Lin认为在液-固吸附色谱过程中,吸附剂与流动相接触的表面存在着一个滞流层。滞流层由几乎静止的流动相组成,而流动相中的物质在自由扩散的作用下,穿过滞流层与吸附剂表面的物质起到交换的作用。他们命名这个模型为间隙滞流体模型(Interstitial Stagnant Fluid Model)[3, 4]。在这个模型中,吸附剂被视为均匀的多孔球体,流动相中的组分经过在三维空间的扩散穿过滞流层, 引起固定相颗粒内部物质浓度的变化。根据这个概念导出了液相色谱塔板高度方程:

公式(1)中的符号说明见文献[5]。在Horvath和Lin的公式中没有考虑在色谱过程中流动相摩擦升温对塔板高度的影响,在当年这是可以接受的。但随着UPLC的产生,色谱柱前压力的大大增高,流动相摩擦升温对塔板高度的影响就不能不考虑了。

在此,笔者从色谱理论出发,推导包含流动相摩擦升温因素在内的塔板高度方程。这个方程既可以描述传统的HPLC过程也可以描述现代的UPLC过程。有了关于UPLC过程动力学的研究,我们才明确知道有哪些因素影响到UPLC的柱效率,也为UPLC下一步发展和后UPLC时代提供指导方向。

1 基础知识

从理论上讲，UPLC与HPLC并无实质性的区别之处,只是UPLC用的填料颗粒更细,所需要的柱前压力也就更高,流动相摩擦生热明显起来,因此在色谱塔板高度方程中必须考虑流动相在柱内温度分布场对柱效率的影响。也就是说UPLC的塔板高度方程应该是在Horvath和Lin的公式的基础上再加上柱内温度分布场对塔板高度的贡献。

通过色谱理论分析我们知道,塔板高度H具有这样的统计意义,即代表色谱流出曲线与其数学期望值的离散程度。根据概率统计理论,有限个独立随机变量和的方差等于它们方差的和。因此,如果存在n种互相独立的影响色谱区域宽度的因素,总的塔板高度H等于各种因素对塔板高度的贡献Hi之和[6]

温度场对塔板高度的影响是一个独立因素,因此如果温度场对塔板高度的贡献为H热,考虑柱内温度分布场对塔板高度的贡献的塔板高度方程应当是在Horvath和Lin的公式基础上加上H热项,如下：

关键是我们要求出H热由哪些因素确定以及H热的表达式。

根据色谱过程动力学理论,塔板高度与弥散系数有关,H热与相应的热弥散系数D热关系为

其中D热为因温度场的存在形成谱带弥散的弥散系数, ν 为谱带在柱内移动的平均速度。以下我们将着重讨论影响D热的因素。
2 理论推导
2.1 均匀发热无限长度圆柱体内温度场的平衡分布

欲推求D热的表达式必须研究柱管内温度场的平衡分布状况。出发点是经典的热传导方程

其中T为温度(K), f(x,y,z,t)为物体内的热源密度函数。考虑到①柱长度z远大于柱内半径r0以及②平衡时间足够长,柱内温度分布已经稳定,上述三维空间的问题可化为二维平面极坐标求解。可解得在均匀内热源情况下温度沿柱截面径向分布函数为

式中r为离轴心的距离;r0为柱内半径;T0为柱内壁的平衡温度;K为与热源强度、热传导系数有关的常数。理论上对于液体溶剂有K=,其中 λ c为流动相的热传导率; η 为流动相黏度;dp为吸附剂粒度。

色谱柱由大量的吸附剂填充而成,这些固体填充剂对 λ c值的贡献相当大,因此对于填充柱上式可写为

其中 Ψ 为与色谱柱填充材料、填充密度、流动相有关的系数。

柱中心与柱内壁的温差 Δ T=Kr20。因此柱中心与柱内壁的温差与流动相线速度平方成正比;而与填料粒径平方成反比。上式中的u/dp是流动相通过一颗填料颗粒时间的倒数。

2.2 温度场对谱带弥散的影响

温度场对谱带弥散的影响主要体现在两方面:

(1)温度的差异导致流动相黏度的变化,从而引起流动相流速径向分布的差异。根据理论流动相的线速度u

其中柱前、柱后压力差 。

在温度差不太大的情况下

其中 η 0为流动相的温度为T0时的黏度; Δ T为温差T-T0; α 为流动相黏度的温度系数, κ 为柱断面上流动相占有的分数。

考虑到式(6)可知,色谱柱内流动相的径向分布速度为

由于流动相黏度的温度系数 α 取值一般为负值,故可见在柱中心(r=0)处流动相流速最快,柱边缘(r=r0)处流动相流速最慢

(2)柱内温度分布的差异导致组分分配系数的变化,从而引起保留因子k径向分布的差异。保留因子与柱温的关系为

其中a、b为与分子结构有关的常数。

考虑到柱温沿径向的分布可知保留因子沿径向的分布为

综合以上两种因素可知组分在柱内移动的径向的分布函数为

2.3 温度场弥散系数D热对塔板高度的贡献

在进入以下讨论前建议读者阅读一下文献[6]的内容。从公式(9)与(13)可得

其中

将y在r=0处按Taylor级数展开

求得

直接求

的导数有点麻烦。但我们可以看到这个函数是以r=0为对称轴的对称函数,并且在r=0连续而光滑,所以可断定

故

从而

得到

其中Dr为径向弥散系数

其中Dm为流动相的分子扩散系数;De为涡流弥散系数;Dc为组分在柱内沿轴向移动时遇到填料阻挡而产生的径向扩散形成的弥散系数;c为按比例包含各相的综合浓度; ε 1=(c1-c*1)/c*1为浓度偏离平衡的分数。c*1为组分在流动相中的平衡浓度;c1为组分在流动相中的浓度。

如果我们可以数学意义上的一个点进样到色谱柱的起始部位,通过色谱柱后这色谱点不但沿轴向扩散形成色谱峰,而且在柱横断面上组分也由点扩大成一个圆。流动相内的分子扩散、流动相内的涡流扩散以及更重要的因填料的阻挡流动相被迫向径向流动产生的扩散,使得原来在数学意义上的一个点变成一个有面积的圆,这就是径向扩散过程。也就是径弥散系数Dr的物理意义。

从(21)解出 ε 1

在r=r0处(即流动相与管内壁界面处)流动相中的物质不可能扩散进入柱壁内部，因此把r=r0作为相对平衡点，即 ε 1=0,故

因此得到

把谱带的弥散也视为一个扩散输运过程,得到

其中d κ 1表示在柱截面液相占有面积分数的微分,d κ 1=2 πκ rdr,代入上式,注意到 π r20c*1为断面上流动相中组分的量,c为按比例包含各相的综合浓度。故有

为简化积分计算，用断面上流动相线速中值代替u,仍然记为u。进一步解得到

因为

从而

故有UPLC塔板高度方程:

如果采用Interstitial Stagnant Fluid Model, 可以得到：

这就是考虑流动相在柱内温度分布场对柱效率的影响的液相色谱塔板高度方程。上式右端最后一项是温度场对塔板高度的贡献。本方程适用于UPLC过程,当然也适用于HPLC过程。

3 结果与讨论

采用方程(30)计算出来的图形见图1a。

图1 (a)用公式(30)计算出来的UPLC塔板高度H与流动相线速度u的关系以及(b)Horvath和Lin曲线 Fig.1 Relationships of UPLC plate height H and the mobile phase velocity u calculated using (a) UPLC formula (30) and (b) Horvath and Lin’s formula

这个公式指出,在高流动相线速度的情况下UPLC的柱效率与柱内径有关。细粒径的填料要配上细内径的柱才会实现高效。从UPLC塔板高度公式可以看出,在柱前压力较低、流动相线速度较低的情况下最后一项可以忽略,上述公式还原成Horvath和Lin的公式,也就是HPLC的情况;在柱压较高时摩擦生热效应温度场会对塔板高度产生明显的贡献。温度场的贡献与柱内径有关,细柱容易实现高效。这也说明为什么UPLC色谱柱一般比HPLC柱要细。早在上世纪80年代,卢佩章等[7]就提出液相色谱要实现高效应当采用细内径柱。

Δ T=Kr20代表柱中心与柱边缘的温差,因K= Ψ u2/d2p,所以柱中心与柱边缘的温差与流动相线速度的平方成正比,也与柱压的平方成正比。流动相线速度增加到一定程度后,温度场的贡献会显现出来。在UPLC过程中,一旦温度场的效应显示出来,塔板高度将随流动相线速度增加而迅速增加,塔板高度随线速度的增加并非线性关系,从而导致UPLC柱效崩溃。摩擦生热效应给进一步提高分析速度和效能产生了限制。这大概也就是一般供销商不提供极高压力下谱图的原因。

这个公式为今后UPLC的发展指出了方向,从这个公式的研究知道,UPLC还有潜力可挖。在现在基础上进一步减小填料粒度来提高柱效是可行的,但伴随着的是同时要减小柱内径。我们也可以通过减小柱内径来实现在不影响柱效的前提下提高流动相线速度操作范围的目的。

色谱还要不断发展,柱效还要继续提高,后UPLC时代应该怎么做?笔者认为可以采用消除填料表面滞留层的方法进一步提高柱效,即“UPLC+消滞留层”技术。消除填料表面滞留层的方法和原理见有关资料[8]。2013年,四川大学徐小平等[9]采用消滞留层方法,把塔板数增加了20% ,效果明显。

致谢:本文作者系卢佩章、李浩春二位先生1979级研究生。在学习期间二位先生给予了无微不至的关怀和悉心指导。作者借此机会对二位先生的教导、帮助致以最衷心的感谢和崇高的敬意!

参考文献
[1]Ye X W, Peng Y, Niu Z Y, et al. Chinese Journal of Chromatography (叶曦雯, 彭燕, 牛增元, 等. 色谱), 2014, 32(9): 1005
[2]Fan S, Zou J H, Li L P, et al. Chinese Journal of Chromatography (范赛, 邹建宏, 李丽萍, 等. 色谱), 2014, 32(9): 999
[3]Horvath C, Lin H J. J Chromatogr, 1978, 149: 43  
[4]Horvath C, Lin H J. J Chromatogr, 1976, 126: 401  
[5]Dai C Z. Chinese Journal of Chromatography (戴朝政. 色谱), 1999, 17(6): 514
[6]Lu P Z, Dai C Z, Zhang X M. Chromatographic Theory Foundation. 2nd ed. Beijing: Science Press (卢佩章, 戴朝政, 张祥民. 色谱理论基础. 2版). 北京: 科学出版社, 1998
[7]Zhang Y K, Bao M S, Zhou G M, et al. Scientia Sinica: Series B (张玉奎, 包绵生, 周桂敏, 等. 中国科学:B辑), 1980(11): 1057
[8]Dai C Z. China Patent (戴朝政. 中国专利), ZL201010516298.3. 2014-01-29
[9]Li D, Li Z K, Lin J, et al. China Measurement & Test (李丹, 李祖琨, 林洁, 等. 中国测试), 2013, 39(4): 52