色谱  2015, Vol. 33 Issue (3): 309-313   PDF (802 KB)    
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郑重
孙琦
石永伟
曲佳乐
宋凤瑞
刘志强
高效液相色谱-串联质谱法直接定量分析植物酵素中多种氨基酸成分
郑重1, 孙琦3, 石永伟2, 曲佳乐2, 宋凤瑞1, 刘志强1     
1. 中国科学院长春应用化学研究所国家质谱中心(长春)&吉林省中药化学与质谱重点研究室, 吉林 长春 130022;
2. 吉林敖东大高酵素有限公司, 吉林 延边 133700;
3. 吉林敖东药业集团股份有限公司, 吉林 延边 133700
收稿日期：2014-10-20
基金项目：吉林省重点科技发展计划项目(20120901);吉林省与中国科学院科技合作高技术产业化专项资金项目(2013SYHZ0008).
通讯作者：刘志强,E-mail:liuzq@ciac.jl.cn
摘要：利用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法直接分析植物酵素中多种未衍生化的氨基酸。样品用甲醇稀释5倍,超声提取30 min,离心10 min(速度为10000 r/min),取上清液分析。采用色谱柱Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)分离,以甲醇-乙酸-水混合溶液为流动相体系进行梯度洗脱,流速为0.5 mL/min,质谱喷雾电压为3 kV,离子源温度为150 ℃,去溶剂温度350 ℃,去溶剂气体流速为800 L/h。碰撞气氩气的流速保持压力为0.17 Pa。以被测物的提取离子流图峰面积进行定量,该分析方法的线性范围为0.5~200 μmol/L(r2>0.99),回收率为86%~110%,可对植物酵素中16种氨基酸成分进行定量分析。该方法操作简便快速、准确可靠,还适用于食品、药品及天然产物中多种氨基酸成分的定量分析。
关键词： 高效液相色谱-串联质谱     未衍生化氨基酸     植物酵素    
Direct quantitative analysis of amino acids in fermented beverage of plant extract using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZHENG Zhong1, SUN Qi3, SHI Yongwei2, QU Jiale2, SONG Fengrui1, LIU Zhiqiang1     
1. National Center for Mass Spectrometry in Changchun & Jilin Province Key Laboratory of Chinese Medicine Chemistry and Mass Spectrometry, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022, China;
2. Jilin Aodong-Ohtaka Enzyme Co., Ltd., Yanbian 133700, China;
3. Jilin Aodong Medicine Industry Croup Co., Ltd., Yanbian 133700, China
Received: 2014-10-20
Abstract: A method was established for underivatized amino acid determination in fermented beverage of plant extract. Samples were diluted with methanol for five times, extracted by ultrasonic vibration for 30 min, and high-speed centrifuged for 15 min at 10000 r/min. The supernatant was separated and detected by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The chromatographic column was Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The elution was performed at a flow rate of 0.5 mL/min using the mobile phases of methanol-acetic acid-water mixture. The MS detector was set as follows: ion source voltage 3 kV, ion source temperature 150 ℃, solvent temperature 350 ℃, gas flow rate 800 L/h. The collision gas was argon with a pressure of 0.17 Pa. The quantitation analysis was carried out with peak area in extracted ion chromatograms. Good linearities were acquired in the range of 0.5-200 μmol/L (r2>0.99) for the amino acids. The recoveries were between 86% and 110%. There were 16 amino acids in the fermented beverage of plant extract quantitatively analyzed. The method is simple, rapid, accurate and reliable in quantitative analysis of amino acid samples in the fields of pharmaceutical, food and natural products.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)     underivatized amino acid     fermented beverage of plant extract    

植物酵素(fermented beverage of plant extract[1, 2])是采用日本传统的发酵工艺,从50余种蔬菜、水果、菌类等植物中提取精华液后,经过180 d的微生物发酵作用而获得的具有特殊风味和营养的健康饮品。其富含丰富的营养物质,包括酵素、氨基酸、维生素、矿物质等主要功效成分。具有调节肠道菌群、润肠通便[3]、解酒护肝[4]、增强机体免疫力等作用。其中所含的氨基酸是构成生物体营养所需的基本物质,是生物体内不可缺少的营养成分之一。它具有广泛的生理活性,一是帮助人体完成新陈代谢的过程;二是帮助修复人体病变器官、机体组织的各种损伤;三是提供热量;四是参与抵抗细菌、病毒的侵害。

大多数氨基酸由于极性较强及缺少强发色基团,其分离和检测比较困难。目前常使用氨基酸自动分析仪[5, 6, 7]和柱前衍生反相高效液相色谱法[8, 9, 10, 11, 12]等进行分析。前者存在应用范围有限等不足,后者则存在衍生物不稳定、反应条件繁琐、操作时间长等问题,不利于氨基酸的快速分析。基于上述问题,未经衍生化的氨基酸直接分析越来越受到人们的关注。国内外很多研究人员已报道用蒸发光散射检测器进行未衍生化氨基酸的分析,并且取得了较好的结果[13, 14]。但蒸发光散射检测器受其自身检测限偏高的限制,对于微量样品的分析能力稍显不足。近年来,高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)技术已经成为现代分析手段中必不可少的组成部分,并作为强有力的分析技术,成为生命科学、医药和临床、中药及食品分析等领域中不可或缺的工具之一[15, 16, 17, 18, 19, 20]。近年来国内外科研工作者应用液相色谱-质谱联用技术,研究了不同类别样品中氨基酸的含量[21, 22, 23, 24]。本文采用液相色谱-串联质谱联用方法,成功实现了植物酵素中多种氨基酸的定量分析。

1 实验部分
1.1 仪器、材料与试剂

高效液相色谱-串联质谱联用仪为美国Waters公司的ACQUITY UPLC与Xevo-TQ三重四极杆质谱仪联用,Waters Masslynx V4.1数据工作站;赛多利斯电子分析天平(德国); Eppendorf 5810R高速离心机(德国)。

植物酵素:由吉林敖东大高酵素有限公司提供,性状为液体,产品质量标准为Q/ADDG0001S。氨基酸标准品:甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)、蛋氨酸(Met)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)均购自Sigma公司(美国)。色谱级的甲酸和乙酸购自Tedia公司(美国)。色谱级的甲醇和乙腈购自Fisher Scientific公司(美国)。超纯水来自默克密理博公司的Milli-Q超纯水纯化仪(德国),其他试剂均为分析纯级别。

1.2 实验方法
1.2.1 样品制备

标准溶液配制:称取一定量的待测氨基酸标准品,用0.1 mol/L 的HCl配成2 mmol/L 的混合标准品溶液,再分别稀释成0.1、2.0、5.0、10、25、50、100、160、200 μ mol/L。

样品溶液制备:样品5 mL加甲醇稀释5倍,超声30 min后,再高速离心15 min (10 000 r/min),取上清液即得。

1.2.2 仪器条件

色谱条件:色谱柱Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm,5 μ m)，柱温25 ℃，流速0.5 mL/min，进样量3 μ L；流动相:A相为0.15%(v/v)乙酸水溶液,B相为含0.9%(v/v)乙酸的30%(v/v)甲醇水溶液。梯度程序如下:0～2.5 min,100%A; 2.5～5 min,0～17%B; 5～8 min,17%B～33%B; 8～8.5 min,33%B～100%B; 8.5～17 min,100%B。

质谱条件:电喷雾正离子模式,多反应监测(MRM)模式，喷雾电压3 kV,离子源温度150 ℃,去溶剂温度350 ℃,去溶剂气体流速800 L/h，碰撞气氩气压力0.17 Pa。其他参数见表1。通过MassLynx4.1获得数据,使用TargetLynx软件(Micromass,UK)进行数据处理。

2 结果与讨论
2.1 MS/MS条件的优化

在HPLC-MS/MS定量分析方法中,确定适合每个分析物的最佳质谱条件非常重要。因此,我们优化了每种氨基酸的最佳锥孔电压和最佳碰撞能量,保证在分析中每个分析物都能得到特异性强和灵敏度高的分析参数。

浓度均为50 μ mol/L 的氨基酸标准溶液通过流动注射器以20 μ L/min 的流速直接进入质谱分析,以优化适合于每种氨基酸分析的锥孔电压和碰撞能量。根据每种氨基酸的结构特征,改变与其对应的锥孔电压及碰撞能量,使其产生的子离子信号最强,稳定性最好。采集的最小碎片离子峰是m/z 40;锥孔电压的范围设置为10～60 V;碰撞能量的范围为5～50 eV。通常每个分析物选取两个丰度最高的的子离子,丰度最大的子离子用于MRM模式下的定量分析,丰度其次的子离子将作为该物质的定性分析离子。氨基酸的定量离子对和相应的最佳锥孔电压和碰撞能量详见表1。在这些特殊离子对中,大部分的氨基酸都产生丢失一个甲酸的中性碎片产物[M+H-46]+。

表1 氨基酸的质谱分析条件 Table 1 MS analysis conditions of amino acids
2.2 液相色谱条件的优化

利用建立的HPLC-MS/MS方法分析氨基酸标准品时,得到了较好的谱图(见图1)。通常氨基酸的液相色谱-质谱联用定量分析时需要加入内标化合物[25],但通过与L-谷氨酰胺和N,N-二甲基-L-苯丙氨酸为内标的实验结果对比,本方法结果与其比较并无显著性差异(p＜0.05),且方法更为简便。

图1 16种氨基酸混合标准溶液的色谱图 Fig.1 Chromatogram of a mixed standard of the 16 amino acids
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的绘制

采用外标法考察氨基酸的标准曲线。即配制不同浓度的氨基酸混合标准溶液(0.5、1.0、2.0、10、25、50、100、200 μ mol/L),按2.1节、2.2节描述条件进行实验,其MRM色谱图见图2。以氨基酸峰面积作为纵坐标y,相应氨基酸的浓度为横坐标x绘制标准曲线,结果显示,每个标准曲线的线性回归相关系数(r2)均高于0.99,每种氨基酸的峰面积与其浓度在0.5～200 μ mol/L 范围内均显示良好的线性关系(见表2)。

图2 16种氨基酸的MRM色谱图 Fig.2 MRM chromatograms of the 16 amino acids

表2 16种氨基酸的标准曲线 Table 2 Standard curves of the 16 amino acids
2.3.2 精密度及准确度

日内精密度是一天之内对同一样品进行5次测定的RSD值,日间精密度是连续6天对同一样品测定的RSD值。经考察可知,氨基酸的日内精密度RSD＜6% ,日间精密度RSD＜10%(具体结果见表3)。

2.3.3 加样回收率

分别对样品添加高、中、低3个水平(0.5、10、200 μ mol/L)的氨基酸,重复测定3次,样品的回收率为86% ～110%(具体结果见表3)。

表3 氨基酸的日内精密度、日间精密度、加样回收率及其RSD、检出限、定量限 Table 3 Intra-day precisions,inter-day precisions,spiked recoveries and RSDs,limits of detection (LODs),limits of quantitation (LOQs) of amino acids
2.3.4 方法的检出限及定量限

分别以各目标物色谱峰的信噪比(S/N)=3确定检出限(LOD),S/N=10确定定量限(LOQ),使用工作软件进行结果计算,具体结果见表3。

2.4 含量测定

采用1.2节样品制备方法、色谱条件、质谱条件对不同批次的敖东酵素样品进行测定,得到各氨基酸含量见表4。可以看出,酵素中含有比较丰富的氨基酸,不同批次样品的各个氨基酸含量略有差异,这可能与样品本身发酵的时间、环境以及原材料质量差异等因素有关。不同批次间的植物酵素产品中氨基酸含量均大于30 mg/100 mL。

表4 不同批次样品中氨基酸的含量(mg/100 mL) Table 4 Contents of amino acids in different batches of samples (mg/100 mL)
3 结论

本文采用HPLC-MS/MS方法分析敖东酵素中多种未衍生化的氨基酸成分的含量。尽管目前氨基酸的定量分析方法较多,但是本文采用的方法具有较多优势。首先,样品前处理简单,只需要简单的有机试剂提取,不需要衍生化,极大地缩短了分析时间,同时可以避免由衍生化处理带来的误差。其次,将HPLC的高效分离与质谱MRM鉴定相结合,在分析复杂样品时可以获得较高的选择性和灵敏度。该方法精确,准确,重复性好,分析时间相对较短,适用于食品、药品中氨基酸的定性和定量分析。

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