本实验检测的104种目标化合物的性质差异较大,对比研究了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、乙酸铵甲醇溶液-乙酸铵水溶液作为流动相的结果。发现在甲醇-水体系下的响应优于乙腈-水体系。而流动相中加入适量的乙酸铵可以使待测物在测试时成为离子状态,然后在电喷雾过程中将离子从溶液中转移至气相中,使气相离子的生成过程更容易完成,从而提高待测物的离子化效率；同时还可以抑制待测物与色谱柱固定相中残留硅羟基之间的“二次作用”,达到改善峰形、提高分离效果的作用；而且有机相与水相中盐浓度相等,也保证了梯度变化过程中盐的浓度和离子化氛围酸性稳定。因此,最终本实验采用10 mmol/L 乙酸铵甲醇溶液-10 mmol/L 乙酸铵水溶液作为流动相体系。

本实验采用Restek C18色谱柱,填料粒径为3 μ m,与常规液相色谱柱相比具有更高的灵敏度和分离能力,且分离时间较常规液相色谱柱大大缩短。通过优化色谱分离条件,使目标化合物与抑制电离的基质实现最大程度的有效分离,可以降低基质对质谱检测的影响。空白基质中104种化合物的MRM色谱图如图1所示。

图1

Fig. 1

图1 空白基质中104种化合物的MRM色谱图(0.01 mg/kg) Fig.1 MRM chromatograms of the matrix-matched standards of the 104 analytes (0.01 mg/kg)

本研究尝试使用大气压化学电离(APCI)源和ESI⁺源。发现使用APCI源时噪声基线低,但目标物的响应值也偏低;ESI⁺条件下响应较好,满足灵敏度要求。用蠕动泵以10 μ L/min的流速连续注射,分别将0.5 mg/L 的每组农药标准溶液注入ESI源中,在正离子检测方式下进行一级质谱分析(Q1扫描),得到准分子离子峰[M+H]⁺,优化去簇电压。对准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描),得到二级质谱碎片的全谱信息,优化碰撞能,同时建立标准物质二级碎片谱库,以便谱库检索能够实现对化合物同时定性定量的目的。此外,还对离子源温度、雾化气、气帘气、辅助气等参数进行了优化,优化的条件见1.3节。

在进行提取试剂的优化实验时选择了6种提取方案,分别是(A)5 g油与5 mL正己烷混合,以5 mL乙腈提取,共提取两次,合并提取液;(B)5 g油与5 mL正己烷及5 mL水混合,以5 mL乙腈提取,共提取两次,合并提取液;(C)5 g油与5 mL乙腈饱和的正己烷以及5 mL水混合,以5 mL乙腈提取,共提取两次,合并提取液;(D)5 g油与5 mL水混合,加入1 g氯化钠,以5 mL乙腈提取,共提取两次,合并提取液;(E)5 g油,以5 mL乙腈提取,共提取两次,合并提取液;(F)5 g油,以10 mL乙腈提取一次。以0.05 mg/kg 的104种目标化合物为样品,采用了两种方式比较提取试剂的优劣:其一为比较回收率(见图2),其二为称量共提取物(见图3)。两种方式的结果都充分说明提取方式B为最优化方案。

图2

Fig. 2

图2 提取方法的优化 Fig.2 Optimization of extraction methods A. 5 g oil dissolved in 5 mL hexane,extracted with 10 mL acetonitrile (MeCN) (5 mL/time),combine MeCN extracts; B. 5 g oil dissolved in 5 mL hexane and 5 mL water,extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; C. 5 g oil dissolved in 5 mL hexane saturated with MeCN and 5 mL water,extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; D. 5 g oil dissolved in 5 mL water,add 1g NaCl,extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; E. 5 g oil extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; F. 5 g oil extracted with 10 mL MeCN. Mass concentration: 0.05 mg/kg.

图3

Fig. 3

图3 冷冻时间的优化 Fig.3 Optimization of frozen time A. 5 g oil dissolved in 5 mL hexane,extracted with 10 mL acetonitrile (MeCN) (5 mL/time),combine MeCN extracts; B. 5 g oil dissolved in 5 mL hexane and 5 mL water,extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; C. 5 g oil dissolved in 5 mL hexane saturated with MeCN and 5 mL water,extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; D. 5 g oil dissolved in 5 mL water,add 1 g NaCl,extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; E. 5 g oil extracted with 10 mL MeCN (5 mL/time),combine MeCN extracts; F. 5 g oil extracted with 10 mL MeCN.

对上述优化结果进行了分析。首先,乙腈的通用性强,对农药的溶解度较大,可溶入的杂质量适中,是目前针对多残留提取较为普遍的选择。其次,由于植物油中含水量极低,并且具有一定的黏性,单纯使用乙腈在提取时可能存在分散不够完全的现象,加入少量的水,提高了乙腈对于样品的渗透性,可以将基体分散得非常均匀。再次,除油脂外,正己烷中可溶入的杂质量比较少,特别是正己烷与水进行两相分配时,大部分杂质在水相中;对于植物油样品来说,由于其与乙腈互溶性不佳,直接提取效率不高,所以先使用正己烷溶解,再用乙腈萃取,这样既可以提高对目标物的提取效率,又可以减少植物油中最主要的干扰杂质油脂的溶入量,对后续进行的净化步骤有利。故本方法最终先采用正己烷-水溶解分散基质,再加入乙腈溶液提取,最后加盐至盐析分层。操作简单,净化效果显著,提取效率高。

在进行了提取步骤以后,虽然大部分的油脂保留在残渣内,但仍有少部分进入了乙腈层。为了进一步净化,采用了冷冻的方式去除油脂。将不同提取方式得到的乙腈提取层同时放入-18 ℃冰箱内冷冻,间隔一段时间后取出2 mL提取液,吹干后称重,利用差减法绘制出冷冻效果曲线(见图3)。随着冷冻时间的延长,提取液中的油脂含量显著下降,但当冷冻时间达到2 h以后,该趋势趋于平稳。因此认为冷冻2 h较合适。

在进行D-SPE条件优化时,选择了3种净化方案:50 mg MgSO₄和50 mg PSA; 150 mg MgSO₄、50 mg PSA和50 mg C18; 150 mg MgSO₄、50 mg PSA、50 mg C18和10 mg GCB。以0.05 mg/kg 的104种目标化合物为样品,先在上文优化的条件下进行LLE,提取液用于分散固相萃取净化条件的优化(见图4)。

图4

Fig. 4

图4 D-SPE条件的优化(0.05 mg/kg) Fig.4 Optimization of D-SPE (0.05 mg/kg)

提取液经液液分配除去部分杂质后,再使用C18和PSA粉末分别吸附非极性和极性杂质,净化效果良好。C18材料的硅胶上接有十八烷基,为其有效成分,有较高的相覆盖率和碳含量,对非极性物质有较高的容量,特别对油脂的去除有十分显著的效果,同时还可以去除其他一些非极性的杂质。 PSA材料的硅胶表面键合有极性官能团(氨基),为其有效成分,能从样品中吸附极性化合物,再应用比样品本身极性更强的溶剂来洗脱分析物。PSA对样品中的一些强极性杂质、有机酸、色素和金属离子(通过配合作用)等具有良好的净化效果。无水MgSO₄用于除去盐析分配后乙腈层中含有的少量水分,以免PSA粉末吸水导致性能下降。虽然加入少量GCB粉末可以去除部分色素,但对于一些平面结构的化合物可能产生吸附作用而导致回收率下降。综合考虑,选择MgSO₄、PSA和C18进行D-SPE。