色谱  2015, Vol. 33 Issue (1): 75-79   PDF (776 KB)    
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周晓
李小兰
陈志燕
叶长文
周芸
孟冬玲
高效液相色谱法测定水基胶黏剂中3种异噻唑啉酮类杀菌剂
周晓1 , 李小兰1, 陈志燕1, 叶长文2, 周芸1, 孟冬玲1    
1. 广西中烟工业有限责任公司, 广西 南宁 530001;
2. 中国烟草总公司郑州烟草研究院, 河南 郑州 450001
收稿日期：2014-10-20
通讯作者：周晓,E-mail:5935164@qq.com
摘要：建立了一种高效液相色谱法快速测定水基胶黏剂中3种异噻唑啉酮类杀菌剂(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)和1,2-苯并异噻啉-3-酮(BIT))的分析方法.样品经甲醇-水(1: 1, v/v)溶液振荡提取、离心、过滤后,采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测,C18色谱柱分离,流动相为甲醇-水,梯度洗脱.对前处理条件(包括萃取溶剂、提取方式、稀释倍数、提取时间)进行了优化.在优化实验条件下,样品中的异噻唑啉酮在0.25~10.0 mg/L范围内呈良好的线性关系(r2≥0.9992),加标回收率在92%~103%之间,相对标准偏差不高于4%,检出限为0.43~1.14 mg/kg,定量限为1.44~3.81 mg/kg.结果表明该方法能达到定量检测的目的.将该方法应用于实际样品的检测,结果可靠.
关键词： 高效液相色谱     异噻唑啉酮类杀菌剂     水基胶黏剂    
Determination of three isothiazolinone biocides in water-borne adhesives by high performance liquid chromatography
ZHOU Xiao1 , LI Xiaolan1, CHEN Zhiyan1, YE Changwen2, ZHOU Yun1, MENG Dongling1    
1. China Tobacco Guangxi Industrial Limited Liability Company, Nanning 530001, China;
2. Zhengzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corporation, Zhengzhou 450001, China
Received: 2014-10-20
Abstract: A rapid high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the quantitative analysis of three isothiazolinone biocides (2-methyl-4-isothiazolin-3-one (MI), 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one (CMI) and 1,2-benzylisothiazolin-3-one (BIT)) in water-borne adhesives. The sample was extracted with methanol-water (1: 1, v/v), and purified by centrifugation and filtration. The isothiazolones were separated on a C18 column with methanol-water as mobile phases under gradient elution and detected with a diode array detector (DAD). The pretreatment factors such as extraction solvent, extraction method, dilution ratio, extraction time were optimized. Under the optimized conditions, the targets had good linearities (r2≥0.9992) in the range of 0.25-10.0 mg/L. The recoveries were between 92% and 103% with the relative standard deviations not more than 4%. The limits of detection (LODs) were between 0.43 mg/kg and 1.14 mg/kg. The limits of quantification (LOQs) were between 1.44 mg/kg and 3.81 mg/kg. The results showed that the method can achieve the purpose of quantitative detection. The analyses of real samples verified the reliability of this method.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     isothiazolone biocides     water-borne adhesives    

随着工业的发展,水基胶黏剂的应用市场越来越广泛,其具有无溶剂释放,环境友好、无毒、不可燃、使用安全、成本低等优点。但水基胶黏剂通常会使用一些杀菌剂来延长其保质期。其中,异噻唑啉酮类杀菌剂是一类新型的高效广谱防腐杀菌剂,由于其用量小,与各种乳化剂、表面活性剂及蛋白质成分配伍性好,因此广泛用于化妆品、胶黏剂、制浆造纸等行业防腐杀菌。其中,2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)和1,2-苯并异噻啉-3-酮(BIT)是工业上常用的防腐剂[1, 2]。

异噻唑啉酮类化合物除对皮肤有致敏反应,会出现眼睛、皮肤接触发生过敏或皮炎等症状外,还可导致皮肤灼伤或哮喘,其中,CMI和MI是致敏性最强的异噻唑啉酮类衍生物,首次接触即可致敏,属强变应原[3]。另外据报道其具有细胞毒性与神经毒性,一定浓度下与皮肤接触会产生过敏反应,吸入或不慎吞咽更对人体有害。因此,各国在玩具、食品、化妆品等领域对上述异噻唑啉酮类杀菌剂的用量、残留量和特定迁移量有严格的限制,如欧盟玩具协调标准EN71-9-2005(MI、CMI和BIT的限量分别为10、10和5 mg/kg,并且MI和BIT总限量为15 mg/kg)、我国GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》(MI、CMI和BIT的特定迁移限量分别为0.5 mg/kg、不能检出和1.2 mg/kg),我国和欧盟化妆品法规对MI和CMI的限量均分别为0.01%和 0.001 5% 。

目前,水基胶黏剂主要用于包装印刷、木材加工、建筑等行业，如果用于食品包装,水基胶黏剂残留过多的异噻唑啉酮类杀菌剂就会迁移到食品中,对人体健康造成安全隐患。目前,对于异噻唑啉酮类杀菌剂测定方法的研究,报道的方法检测对象有化妆品[4, 5]、皮革[6]、食品包装纸[7, 8]、玩具[2, 9],而胶类中异噻唑啉酮类杀菌剂的研究尚属空白,因此,有必要建立相应的分析方法,对水基胶黏剂中异噻唑啉酮类杀菌剂残留量进行研究,以便于掌握残留量的普遍状况和水平,对进一步规范水基胶黏剂中异噻唑啉酮类杀菌剂的使用具有重要意义。

在已报道的分析方法中,碘量法容易产生干扰[10],光度法操作繁琐,且选择性不强[11, 12],HPLC是最常用的检测方法[2, 9, 13, 14, 15],且已有标准检测方法也为液相色谱法[5, 9, 16],同时相对于气相色谱法,液相色谱法更适用于异噻唑啉酮类杀菌剂这类极性较强和沸点较高的化合物。在检测器的选择上,质谱较为昂贵,普及率不高,而高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)使用普遍,因此选择HPLC-DAD进行研究。本文以甲醇-水(1 ∶ 1,v/v,下同)溶液作为萃取溶液,振荡提取、离心、过滤后,采用HPLC-DAD检测,分析时间短,灵敏度高。本文同时探讨了萃取溶剂、萃取方式、固液比、萃取时间等因素对3种异噻唑啉酮杀菌剂检测的影响。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

DIONEX U3000型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器、自动进样器、梯度泵、柱温箱(美国Thermo公司); Mettler XS205型电子天平(感量:0.000 1 g,瑞士Mettler公司); Sigma3-30K台式高速离心机(德国Sigma公司); HY-8A大容量振荡器(金坛市国旺实验仪器厂); KQ-500DV型数控超声波清洁器(昆山市超声仪器有限公司);实验用水均为美国Millipore Advantage A10制备的去离子水(电阻率≥18.2 M Ω ·cm); MI(≥98.0% )、CMI(≥99.0% )、BIT(≥99.0% )(DR公司);甲醇(色谱纯,美国默克公司);有机相过滤膜(0.45 μ m,上海兴亚净化材料厂);一次性注射器(5 mL,江西洪达医疗器械集团有限公司)。玻璃器皿:各种规格移液管、容量瓶和具塞锥形瓶。

1.2 实验样品

水基胶黏剂因其使用的用途不同,黏度范围较大。实验选取3种不同类型水基胶黏剂异噻唑啉酮阳性样品(样品1为水溶液型水基胶,样品2为水分散型水基胶,样品3乳液型水基胶)进行了样品前处理条件选择实验,以确定适应性最好的样品前处理条件。

1.3 色谱条件

分析柱:Waters Xbridge C18(100 mm×4.6 mm,3.5 μ m);保护柱:AcclaimTM C18柱(10 mm×4.6 mm);柱温:30 ℃;进样量:10 μ L;流速0.6 mL/min; DAD检测波长:0～8 min: 275 nm,8～20 min: 318 nm;流动相A为水,B为甲醇;梯度洗脱程序为:0～12 min,B由10%升为90% ,保持2 min; 14～15 min,B由90%降为10% ,保持5 min。保留时间定性,外标法定量。

1.4 标准溶液的配制

分别准确称取适量的MI、CMI和BIT标准物质,用甲醇配制成质量浓度为 1 000 mg/L 的标准储备溶液;分别取1 mL MI、CMI和BIT的标准储备溶液,用甲醇定容至10 mL容量瓶中,得到质量浓度为100 mg/L 的混合标准中间液;分别取25、50、100、200、500、1 000 μ L的混合标准中间液,用甲醇-水(1 ∶ 1)溶液定容至10 mL容量瓶中,得到0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L 系列质量浓度的标准溶液。

1.5 样品前处理

称取水基胶黏剂样品0.25 g,精确至0.1 mg,置于50 mL具塞三角瓶中,准确加入15 mL甲醇-水(1 ∶ 1)提取溶液,盖紧瓶塞,在振荡器上以160 r/min 振荡30 min,移取约1 mL上层溶液于离心管中,12 000 r/min 离心10 min,取上层清液过0.45 μ m有机相滤膜,然后进行液相色谱分析。

2 结果与讨论
2.1 仪器条件的选择
2.1.1 色谱柱的选择

比较了Thermo Hypersil Gold aQ柱(100 mm×2.1 mm,3 μ m)和Waters Xbridge C18(100 mm×4.6 mm,3.5 μ m)两种柱,目标物峰形均较尖锐,在同样的色谱条件下,Xbridge C18对于3种目标物的分离效果较好,故选择此柱。

2.1.2 流动相和柱温的选择

考察了甲醇-水和甲醇-0.4%乙酸铵2个流动相体系,实验表明,目标物均能完全有效分离,前者的响应值较高,因此选择甲醇-水作为流动相。考察了柱温为30、40、50 ℃时对各组分分离的影响,柱温上升10 ℃,各组分保留时间提前约0.2 min,在3个柱温条件下各组分均能很好分离,且峰形尖锐,峰面积几乎没变化,柱温对目标物的影响不显著,因此,选定30 ℃作为柱温。

2.1.3 最大吸收波长的确定

配制MI、MIT和BIT标准溶液,进行LC-DAD分析,得到紫外全扫描谱图,确定MI、CMI和BIT的最大吸收波长分别为275 nm、275 nm和318 nm,因此根据出峰时间调整检测波长。

2.2 样品前处理条件的选择
2.2.1 提取溶剂的选择

根据异噻唑啉酮类杀菌剂的理化性质以及文献报道,初步筛选出甲醇、水、乙腈、甲醇-水(1 ∶ 1)作为提取溶剂,称取0.50 g的水基胶黏剂,加入30 mL上述4种溶剂,萃取后的实验结果见表1。从表1可以看出,水对MI和CMI的提取效果较好,但对BIT提取效果最差,乙腈对MI的提取效果差,甲醇和甲醇-水(1 ∶ 1)对3种异噻唑啉酮的提取效果均较好,但纯甲醇提取液直接进样时,MI有明显的溶剂效应,这与Gerardo等[17]研究结果一致。为了避免溶剂效应,上机前必须用水稀释,这样就会导致灵敏度降低和实验步骤增加,因此,选择甲醇-水(1 ∶ 1)作为提取溶剂。

表1 4种萃取溶剂对水基胶黏剂中异噻唑啉酮萃取结果的影响 Table 1 Extraction effect of four extraction solvents on three isothiazolinones in water-borne adhesives
2.2.2 提取方式的选择

考察了超声和振荡两种提取方式对水基胶黏剂中异噻唑啉酮的提取效率,选择常用的350 W作为超声功率,160 r/min 作为振荡频率,结果见表2。从表2可以看出,超声和振荡对水基胶黏剂中异噻唑啉酮的提取效果差异不大,振荡略优于超声,因此,选择振荡的提取方式。

表2 不同萃取方式对水基胶黏剂中异噻唑啉酮萃取结果的影响 Table 2 Extraction effect of different extraction methods on three isothiazolinones in water-borne adhesives
2.2.3 稀释倍数的选择

考察了稀释倍数为1 ∶ 20、1 ∶ 40、1 ∶ 60、1 ∶ 80、1 ∶ 100时3种水基胶黏剂的提取效果。结果如图1所示,当稀释倍数减小至1 ∶ 60后样品含量趋于稳定,因此,选择稀释倍数为1 ∶ 60。

图1 稀释倍数对水基胶黏剂中异噻唑啉酮提取效果的影响 Fig.1 Effects of the dilution multiple on extraction effect of isothiazolinones in water-borne adhesives
2.2.4 提取时间的选择

比较了振荡提取时间为15、30、45、60、90 min时样品中目标物的含量,实验结果见表3,可见振荡提取时间对目标物含量测定的影响不明显,30 min以后目标物含量基本没有变化,因此选择振荡时间为30 min。

在上述优化实验条件下,异噻唑啉酮的标准溶液及水基胶黏剂样品1的色谱图见图2。

表3 提取时间对水基胶黏剂中异噻唑啉酮提取效果的影响 Table 3 Effects of extraction time on extraction efficiencies of isothiazolinones in water-borne adhesives
2.3 线性范围、检出限、定量限与精密度

在优化的色谱条件下,对质量浓度为0.25～10.0 mg/L 的标准工作溶液进行测定,以目标物峰面积(Y)对标准工作溶液的质量浓度(X)进行线性回归,得到线性回归方程,异噻唑啉酮在0.25～10.0 mg/L 范围内呈良好的线性关系,相关系数r2≥0.999 2。将最低浓度的标准溶液平行测定10次,所得测定结果标准偏差的3倍即为测定方法的检出限,10倍为定量限,检出限(LOD)为0.43～1.14 mg/kg,定量限(LOQ)为1.44～3.81 mg/kg。为了 考察方法的精密度,对样品进行了日内和日间平行测定,各试样各平行处理6份,日间各连续处理6天,计算目标物的相对标准偏差(RSD),日内RSD为1.6% ～2.3% ;连续6天测定,日间RSD为2.3% ～3.6% ,表明本方法的重复性较好(见表4)。结果表明该方法能达到定量检测的目的。

图2 (a)异噻唑啉酮标准溶液及(b)水基胶黏剂 样品的LC色谱图 Fig.2 LC chromatograms of (a) isothiazolinone standards and (b) a water-borne adhesive sample

表4 MI、CMI、BIT的标准曲线、方法检出限、定量限和相对标准偏差 Table 4 Regression equations,the limits of detection (LOD),the limits of quantification (LOQ) and relative standard deviations (RSDs) for MI,CMI and BIT
2.4 回收率和精密度

取空白样品和样品3,分别添加低、中、高3个水平的标准溶液,按优化的方法测定异噻唑啉酮的含量,计算方法的回收率,结果见表5。由表5可以看出,异噻唑啉酮的回收率在92% ～103%之间,表明本方法的准确性较高。

表5 水基胶黏剂中异噻唑啉酮的回收率(n=6) Table 5 Recoveries of isothiazolinones in water-borne adhesives (n=6)
2.5 实际样品的分析

应用所建立的方法测定市售的12种水基胶黏剂中异噻唑啉酮的残留量。从表6结果看,市售水基胶黏剂中异噻唑啉酮的含量范围在1.62～73.83 mg/kg 之间,实现了水基胶黏剂中异噻唑啉酮杀菌剂的快速测定。

表6 实际水基胶黏剂中异噻唑啉酮的含量 Table 6 Contents of isothiazolinones in actual water-borne adhesives
3 结论

本文建立了HPLC测定水基胶黏剂中异噻唑啉酮杀菌剂的方法。采用梯度淋洗,实现了水基胶黏剂中异噻唑啉酮杀菌剂的快速测定。在优化的实验条件下,样品中的异噻唑啉酮在0.25～10.0 mg/L 范围内呈良好的线性关系(r2≥0.999 2),加标回收率在92% ～103%之间,相对标准偏差不高于4% ,检出限为0.43～1.14 mg/kg,定量限为1.44～3.81 mg/kg。该方法灵敏度高,重复性好,回收率满意,可应用于水基胶黏剂中异噻唑啉酮杀菌剂的测定。

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