QuEChERS结合液相色谱-串联质谱法快速测定奶酪中多类兽药残留


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曹亚飞^1,2, 康健^2,3, 常巧英^2,3, 胡雪艳², 王志斌^2,3, 范春林² , 王明林¹

1. 山东农业大学食品科学与工程学院, 山东泰安 271018;
2. 中国检验检疫科学研究院, 北京 100123;
3. 燕山大学环境与化学工程学院, 河北秦皇岛 066004

收稿日期：2014-10-27

基金项目："十二五"国家科技支撑项目(2012BAD29B01).

通讯作者：Tel:(010)85783526,E-mail:caiqfcl@163.com(范春林);Tel:(0538)8249241,E-mail:mlwang@sdau.edu.cn(王明林)

摘要：建立了一种快速测定奶酪中大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类和四环素类共50种兽药残留的分析方法。方法采用改进后的QuEChERS对奶酪进行前处理。样品在加入Na₂EDTA缓冲液和陶瓷均质子后,在5%(v/v)醋酸乙腈条件下进行振荡提取,氯化钠和无水硫酸钠用于盐析,经C₁₈吸附剂净化后,供液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定。目标化合物经ZORBAX-SB-C₁₈柱梯度分离,在正离子动态多反应监测模式下进行检测。结果表明,奶酪中50种兽药的定量限(LOQ)为0.05~20 μg/kg;在3个添加浓度(20、50、100 μg/kg)下(n=6),平均回收率在70%~120%范围内的比例分别为94%、92%和96%,相对标准偏差(RSD)为1%~14%。对市售的7个样品进行测定,其中两个样品分别检出了微量的罗红霉素和氟甲喹兽药残留。该方法快速简便,适用于奶酪中兽药残留的快速检测和日常监控。

关键词： QuEChERS 液相色谱-串联质谱兽药奶酪多残留

Multi-residue determination of veterinary drugs in cheese by QuEChERS and liquid chromatography- tandem mass spectrometry

CAO Yafei^1,2, KANG Jian^2,3, CHANG Qiaoying^2,3, HU Xueyan², WANG Zhibin^2,3, FAN Chunlin² , WANG Minglin¹

1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China;
2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China;
3. College of Environmental and Chemical Engineering, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, China

Received: 2014-10-27

Abstract: A rapid and sensitive method has been developed for the simultaneous determination of 50 veterinary drugs (including macrolides, quinolones, sulfonamides, and tetracyclines) in cheese using a modified QuEChERS method coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). After adding Na₂EDTA buffer solution and ceramic homogenizer, the cheese sample was extracted by 5% (v/v) acetic acid-acetonitrile, sodium chloride and anhydrous sodium sulfate were used for salting-out process. The resulting supernatant solution was purified by C₁₈ sorbent and the re-dissolved solution was analyzed by LC-MS/MS under dynamic multi-reaction monitoring (dynamic MRM) mode via positive electrospray ionization with a ZORBAX-SB-C₁₈ column. The limits of quantification (LOQ, S/N=10) of the target compounds ranged from 0.05 μg/kg to 20 μg/kg in cheese. At spiked levels of 20, 50, 100 μg/kg (n=6), the percentages of drug with a recovery between 70% and 120% were 94%, 92%, and 96%, respectively. The relative standard deviations (RSDs) were between 1% and 14%. This method has been applied to determine seven real samples from markets. Roxithromycin and flumequine have been detected in two samples separately. The results demonstrated that this simple, rapid and accurate method is suitable for the detection of multi-class veterinary drugs in cheese.

Key words: QuEChERS liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) veterinary drug cheese multi-residues

奶酪由牛奶浓缩精制而成,是原奶用量最大的乳制品之一,也是世界上消费量较大的乳制品之一。在奶牛饲养过程中,兽药被用于防治疾病。由此造成兽药及其代谢物残留在原奶中,并进入食物链,进而对人类的健康造成危害^[1]。针对乳制品,美国^[2]、欧盟^[3]及日本^[4]均制定了严格的兽药最大残留限量(MRLs),中国也于2002年公布了含有相关内容的235公告^[5]。但是,目前还没有国家或相关组织明确制定针对奶酪基质的MRLs。在当今奶酪市场不断发展壮大的同时,为做到食品安全预警,保证消费者健康,研究建立一种快速、高效、灵敏、准确的奶酪中兽药多残留分析技术十分必要。

目前,国内关于奶酪中兽药残留分析的研究较少,而国外已有相关报道,如Anastasio等^[6]利用固相萃取法结合高效液相色谱测定了奶酪中伊维菌素兽药残留,Berardi等^[7]和Bogialli等^[8]均利用传统热水萃取法结合液相色谱-串联质谱分别测定了奶酪中12种磺胺类和4种四环素类兽药残留。但是这些研究大多以分类检测为主,同时快速检测奶酪中多类兽药残留的分析方法还相对缺乏。QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe的简称)方法首先应用于农药多残留检测^{[9, 10, 11]}。该方法快速、耐用、安全等特点使其在农药残留检测领域很快脱颖而出,各国研究者纷纷改进并建立了针对不同基质的QuEChERS方法^{[12, 13, 14, 15, 16]}。在兽药残留分析方面,由于基质更加复杂,且目标物化学性质存在显著差异,原始的QuEChERS需要进行改进和优化。近年来,各国分析工作者不断地探索该方法在兽药残留检测中的发展应用,如Stubbings等^[17]通过比较不同的提取净化步骤,最终采用1%乙酸乙腈和无水硫酸钠进行提取,选择NH₂吸附剂作为净化剂结合LC-MS/MS测定了鸡肉中多种兽药残留。Aguilera-Luiz等^[18]利用一种只保留萃取步骤的QuEChERS方法测定了牛奶中18种兽药残留,该方法采用Na₂EDTA缓冲液和1%乙酸乙腈,并且加入无水硫酸镁和氯化钠进行提取,取得了较为满意的结果。高馥蝶等^[19]选用含1%甲酸的乙腈溶液作为提取剂,同时加入无水硫酸钠和氯化钾盐析,选择C₁₈作为净化剂结合超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱同时测定了牛奶中13种农药残留和29种兽药残留。

本文针对奶酪基质的特点,对原始QuEChERS方法的提取和净化过程分别进行了优化,并且对该方法的基质效应、检出限、定量限、回收率及精密度等指标进行了评价与验证,建立了奶酪中4类50种兽药残留的检测方法,并成功应用于市售奶酪样品的检测。

1 实验部分

1.1 试剂、药品及材料

兽药标准品,纯度≥95%(Dr. Ehrenstorfer GmbH);乙腈、甲醇均为色谱纯(HoneyWell);甲酸、冰醋酸、乙二胺四乙酸钠(Na₂EDTA)、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙酸钠(NaAc)、乙酸铵、硫酸镁(MgSO₄)、无水硫酸钠(Na₂SO₄)和氯化钠(NaCl)均为分析纯,购于北京化学试剂厂;C₁₈、 N-丙基乙二胺(PSA)和NH₂吸附剂均购于天津Bonna-Agela公司;实验所用奶酪样品均购于本地超市。

单标准与混合标准储备液的配制:准确称取约10.0 mg标准品于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度;取相应量的单标准储备液至100 mL容量瓶中,用甲醇定容,所有标准溶液均在4 ℃下避光保存。

1.2 仪器及设备

Agilent 1290-6460液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子(ESI)源;涡旋混匀器(日本AS ONE,TRIO TM-1N);陶瓷均质子(美国Agilent,5982-9313);振荡器(日本TAITEC,SR-2DS);低温冷冻离心机(SIGMA,3-30K);电子天平(瑞士Mettler Toledo,PL602-L); Milli-Q超纯水机(美国Millipore);氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates,EVAP 112)。

1.3 LC-MS/MS条件

色谱柱为ZORBAX SB-C₁₈(100 mm×2.1 mm,3.5 μ m);流动相A为0.005 mol/L 乙酸铵-0.1% (v/v)甲酸-水,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～6 min由5%B升至15%B; 6～20 min由15%B升至30%B; 20～26 min由30%B升至80%B; 26～30 min由80%B升至100%B,然后保持5 min; 35～36 min由100%B降至5%B。分析时间为36 min,后运行时间4 min;流速为0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:10 μ L。

ESI源;扫描方式:正离子扫描(Positive);监测方式:动态多反应监测(dynamic MRM);喷雾电压:4 000 V;雾化气压力:0.31 MPa;干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:10 L/min;鞘气温度:350 ℃;鞘气流速:11 L/min;各类兽药的保留时间、母离子、子离子、碰撞能量和碎裂电压(fragmentor)见表1。

表1 50种兽药的质谱信息、检出限、定量限、线性范围、加标回收率及相对标准偏差(RSD) Table 1 MS parameters,LODs,LOQs,linear ranges,recoveries and RSDs of the 50 veterinary drugs

No.	Compound	t_R/min	Transition (m/z) (Collision energy/V)	Fragmentor/V	LOD/( μ g/kg)	LOQ/( μ g/kg)	Linear range/( μ g/kg)	Spiked level/( μ g/kg)	Recovery/%	RSD/%(n=6)
1	azithromycin	13.4	749.5＞158.0^*(60)	180	0.15	0.5	2-200	10	80	4
	(阿奇霉素)		749.5＞591.5(40)					25	79	5
								50	81	3
2	clindamycin	13.1	425.2＞126.1^*(30)	120	0.015	0.05	2-500	10	72	1
	(克林霉素)		425.2＞377.2(10)					25	68	5
								50	71	2
3	josamycin	24.4	828.5＞109.0^*(60)	200	0.075	0.25	2-500	10	78	2
	(交沙霉素)		828.5＞174.1(40)					25	74	5
								50	82	2
4	roxithromycin	23.5	837.6＞158.1^*(35)	140	0.015	0.05	2-500	10	79	3
	(罗红霉素)		837.6＞679.5(5)					25	75	6
								50	78	2
5	spiramycin	13.5	843.6＞174.0^*(25)	200	0.015	0.05	10-500	10	84	5
	(螺旋霉素)		843.6＞101.1(25)					25	78	7
								50	85	4
6	tiamulin	22.9	494.3＞192.2^*(20)	160	0.015	0.05	2-200	10	78	9
	(泰妙菌素)		494.3＞119.0(45)					25	79	3
								50	83	5
7	tylosin	22.1	916.5＞174.0^*(45)	180	0.015	0.05	2-500	10	69	8
	(泰乐菌素)		916.5＞772.2(35)					25	70	6
								50	81	5
8	dapsone	8.3	249.1＞108.0^*(15)	160	0.3	1	2-200	20	84	13
	(氨苯砜)		249.1＞156.0(15)					50	74	14
								100	71	7
9	sulfabenzamide	12.2	277.1＞156.0^*(10)	80	0.6	2	2-200	20	77	7
	(苯甲酰磺胺)		277.1＞92.0(35)					50	75	6
								100	77	3
10	sulfacetamide	3.1	215.0＞92.1^* (5)	60	0.3	1	2-200	20	75	5
	(磺胺醋酰)		215.0＞156.0(20)					50	73	7
								100	79	5
11	sulfachinoxaline	14.4	301.1＞156.0^*(10)	80	0.6	2	2-200	20	79	8
	(磺胺喹噁啉)		301.1＞92.0(30)					50	72	8
								100	79	3
12	sulfachloropyridazine	8.7	285.0＞155.9^*(15)	80	0.6	2	2-200	20	78	10
	(磺胺氯哒嗪)		285.0＞91.9(40)					50	78	7
								100	74	3
13	sulfaclozine	13	285.0＞155.9^*(10)	80	0.6	2	2-200	20	75	9
	(磺胺氯吡嗪)		285.0＞92.1(40)					50	76	7
								100	77	5
14	sulfadiazine	4	251.0＞156.0^*(15)	100	0.6	2	2-500	20	81	7
	(磺胺嘧啶)		251.0＞92.0(40)					50	75	7
								100	77	2
15	sulfadimethoxine	14.1	311.1＞156.0^*(10)	140	0.03	0.1	2-200	20	82	7
	(磺胺二甲氧嗪)		311.1＞92.0(30)					50	77	7
								100	80	3
16	sulfadoxine	10	311.1＞156.0^*(10)	100	0.15	0.5	2-500	20	84	8
	(周效磺胺)		311.1＞92.1(10)					50	78	7
								100	80	2
17	sulfamerazine	5.5	265.1＞156.0^*(15)	100	0.3	1	2-500	20	83	8
	(磺胺甲基嘧啶)		265.1＞92.1(20)					50	74	8
								100	79	1
18	sulfameter	6.9	281.1＞156.0^*(10)	100	0.3	1	2-200	20	87	7
	(磺胺对甲氧嘧啶)		281.1＞92.0(35)					50	76	7
								100	76	3
19	sulfamethazine	7	280.0＞186.0^*(10)	80	0.15	0.5	2-200	20	78	9
	(磺胺二甲嘧啶)		280.0＞156.1(10)					50	80	11
								100	91	6
20	sulfamethizole	6.9	271.0＞156.0^*(15)	80	0.03	0.1	2-500	20	77	11
	(磺胺甲二唑)		271.0＞92.0(40)					50	73	4
								100	75	5
21	sulfamethoxazole	9.7	254.0＞156.0^*(15)	80	0.15	0.5	2-200	20	80	7
	(磺胺甲噁唑)		254.0＞92.0(40)					50	77	7
								100	82	2
22	sulfamethoxypyridazine	7.2	281.0＞156.0^*(10)	80	0.03	0.1	2-500	20	86	8
	(磺胺甲氧哒嗪)		281.0＞92.0(30)					50	75	7
								100	80	2
23	sulfamonomethoxine	8.4	281.0＞156.0^*(10)	100	0.03	0.1	2-200	20	81	10
	(磺胺间甲氧嘧啶)		281.0＞65.1(50)					50	77	7
								100	79	2
24	sulfaphenazole	14.4	315.1＞158.0^*(30)	120	0.15	0.5	2-200	20	80	7
	(磺胺苯吡唑)		315.1＞131.0(50)					50	73	6
								100	75	4
25	sulfapyridine	5	250.0＞92.0^*(35)	80	0.15	0.5	2-500	20	85	5
	(磺胺吡啶)		250.0＞156.0(30)					50	77	7
								100	74	3
26	sulfasalazine	17.4	399.1＞223.0^*(25)	100	6	20	20-500	20	75	7
	(柳氮磺胺吡啶)		399.1＞381.1(20)					50	78	5
								100	83	6
27	sulfathiazole	4.7	256.0＞156.0^*(15)	80	0.15	0.5	2-500	20	78	8
	(磺胺噻唑)		256.0＞92.1(40)					50	72	7
								100	73	4
28	sulfisomidin	3.7	279.1＞186.0^*(10)	120	0.15	0.5	2-500	20	78	6
	(磺胺二甲异嘧啶)		279.1＞124.2(5)					50	67	7
								100	73	3
29	sulfisoxazole	11	268.1＞156.0^*(15)	80	0.3	1	2-500	20	80	7
	(磺胺二甲异唑)		268.1＞92.0(40)					50	71	6
								100	78	3
30	trimethoprim	6.1	291.1＞123.1^*(25)	180	0.03	0.1	2-500	20	82	3
	(甲氧苄啶)		291.1＞230.0(25)					50	76	5
								100	82	3
31	cinoxacin	10.6	263.1＞245.1^*(10)	100	0.3	1	2-500	20	87	3
	(西诺沙星)		263.1＞217.1(15)					50	79	5
								100	83	2
32	ciprofloxacin	7.3	332.2＞231.0^*(60)	120	0.6	2	2-200	20	73	6
	(环丙沙星)		332.2＞314.1(40)					50	77	10
								100	64	7
33	danofloxacin	8	358.2＞340.1^*(5)	120	0.6	2	10-500	20	77	5
	(达氟沙星)		358.2＞82.0(50)					50	73	5
								100	78	2
34	difloxacin	10.4	400.2＞382.2^*(5)	140	0.6	2	2-200	20	88	5
	(二氟沙星)		400.2＞356.2(2)					50	78	5
								100	81	2
35	enoxacin	6.7	321.2＞303.0^*(10)	120	0.6	2	2-200	20	66	6
	(依诺沙星)		321.2＞232.0(30)					50	64	6
								100	70	2
36	enrofloxacin	8.8	360.2＞342.0^*(10)	140	0.03	0.1	2-500	20	84	5
	(恩诺沙星)		360.2＞316.2(10)					50	78	5
								100	81	2
37	fleroxacin	7	370.2＞326.2^*(10)	140	0.03	0.1	2-500	20	78	3
	(氟罗沙星)		370.2＞269.1(40)					50	75	6
								100	81	3
38	flumequine	18.6	262.1＞244.1^*(15)	100	0.15	0.5	2-500	20	78	4
	(氟甲喹)		262.1＞202.0(35)					50	77	4
								100	85	2
39	lomefloxacin	8.1	352.2＞308.2^*(10)	140	0.03	0.1	2-500	20	77	4
	(洛美沙星)		352.2＞265.0(40)					50	72	7
								100	80	2
40	marbofloxacin	6.6	363.2＞345.1^*(20)	120	0.15	0.5	2-500	20	82	7
	(麻保沙星)		363.2＞320.1(20)					50	75	5
								100	75	2
41	nalidixic acid	14	233.1＞215.0^*(10)	80	0.3	1	2-500	20	81	2
	(萘啶酸)		233.1＞104.0(50)					50	73	5
								100	83	2
42	norfloxacin	7	320.1＞302.2^*(20)	140	0.3	1	2-500	20	66	3
	(诺氟沙星)		320.1＞276.1(15)					50	63	5
								100	69	2
43	ofloxacin	7.1	362.1＞344.2^*(20)	160	1.5	5	5-200	20	89	3
	(氧氟沙星)		362.1＞261.1(30)					50	74	6
								100	77	3
44	orbifloxacin	9	396.2＞352.2^*(10)	140	0.15	0.5	2-500	20	86	2
	(奥比沙星)		396.2＞295.2(5)					50	77	5
								100	83	2
45	pefloxacin	7.1	334.1＞316.1^*(15)	80	0.15	0.5	2-500	20	79	5
	(培氟沙星)		334.1＞290.2(15)					50	73	5
								100	75	2
46	sarafloxacin	10.5	386.2＞342.1^*(10)	140	0.03	0.1	2-200	20	83	3
	(沙拉沙星)		386.2＞368.1(40)					50	76	6
								100	82	2
47	sparfloxacin	10.9	396.2＞349.2^*(10)	140	0.03	0.1	2-500	20	84	4
	(司帕沙星)		396.2＞292.1(40)					50	77	7
								100	80	2
48	chlorotetracycline	11.1	479.2＞462.2^*(10)	80	3	10	10-500	20	85	7
	(金霉素)		479.2＞444.2(5)					50	71	9
								100	79	3
49	demeclocycline	8.8	465.2＞448.2^*(10)	180	3	10	20-200	20	80	5
	(地美环素)		465.2＞430.2(5)					50	78	7
								100	75	3
50	tetracycline	7.6	445.2＞410.2^*(10)	100	6	20	20-200	20	80	9
	(四环素)		445.2＞427.2(10)					50	72	6
								100	77	1

1.4 实验步骤

称取1.0 g(精确至0.01 g)奶酪样品于50 mL具塞离心管中,加入5 mL浓度为0.1 mol/L 的Na₂EDTA缓冲溶液(pH 4)和均质子涡旋20 s,50 ℃水浴超声10 min,之后加入10 mL 5%(v/v)的醋酸乙腈提取液,再依次加入1.0 g NaCl和4.0 g Na₂SO₄,快速摇匀,水平振荡提取10 min,于10 ℃ 10000 r/min 离心5 min,取5 mL上清液于含200 mg C₁₈吸附剂的具塞离心管中,水平振荡2 min,以同样条件离心5 min,将2 mL上清液移入10 mL玻璃管中,40 ℃水浴氮吹浓缩至干,加入1 mL 0.1%(v/v)甲酸水-乙腈(8 ∶ 2,v/v)溶解残渣,经超声溶解和涡旋混匀后,过0.22 μ m尼龙滤膜,供LC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

微量的甲酸可以提供ESI源离子化所需的H⁺,从而提高离子化效率。乙腈-水流动相能够提供良好的溶解性和色谱峰形。因此0.1%(v/v)的甲酸水溶液和乙腈通常用作农、兽药多残留液相色谱-质谱检测的流动相。本文通过优化梯度洗脱程序,使大多数兽药取得了良好的分离;在ESI⁺模式下,对50种兽药的母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量等质谱参数进行优化,以获得最佳的响应,并最终建立了动态多反应监测方法。图1为20 μ g/kg 添加浓度下(大环内酯类兽药添加浓度减半)目标化合物在奶酪中的MRM色谱图。

图1 奶酪中50种兽药的MRM色谱图 Fig.1 MRM chromatograms of the 50 veterinary drugs in cheese

由图1可以看出,大部分目标化合物色谱分离情况良好,但对于保留时间相近的少数兽药,也存在色谱峰重叠的现象。由于这些兽药的监测离子不同,故不会对其定性定量结果产生影响。

2.2 提取过程的优化

奶酪质地黏稠,含有较多脂肪、糖类和蛋白质等成分,当前处理方法采用传统QuEChERS时,奶酪样品不易打碎,提取效率不高,这就造成了多种兽药提取效果欠佳。为改善回收率,提取时加入陶瓷均质子用以增强振荡提取的效果。实验结果表明,陶瓷均质子在提取振荡的过程中有效地捣碎了样品,从而进一步提高了萃取效率,4类兽药的平均回收率均有所提高。其中,磺胺类兽药的平均回收率提高最为明显,由70%提高到了80% ,见图2。此外,对于四环素类兽药的测定通常使用Na₂EDTA的缓冲溶液(pH 4)作为提取溶剂^{[20, 21]}。实验结果表明,相比无缓冲溶液条件下,Na₂EDTA缓冲溶液的加入使50种兽药的平均回收率有所提高,其中3种四环素类兽药(金霉素、地美环素和四环素)的回收率分别由60% 、61%和61%提高到81% 、76%和76% ,这与Na₂EDTA缓冲溶液有效抑制了四环素类兽药与金属离子的螯合作用有关。

图 2 陶瓷均质子对不同种类兽药平均回收率的影响 Fig.2 Effect of ceramic homogenizers on recoveries of different kinds of veterinary drugs

2.3 提取液的优化

乙腈具有沉淀蛋白质能力强和共提物少的特点,故传统的QuEChERS方法通常选用乙腈或者酸化乙腈作为提取剂。本实验选用醋酸乙腈作为提取剂,并对提取液的酸度(0%、1% 、3% 、5% 、7% ，v/v)进行了优化。结果表明5%的醋酸乙腈提取效果最好,50种兽药的平均回收率为80% ,96%的目标兽药回收率在70% ～120%范围内,100%的目标兽药回收率在60% ～130%范围内,结果优于其他酸度的醋酸乙腈。

2.4 盐析剂与脱水剂的优化

原始的QuEChERS方法选用NaCl和无水MgSO₄作为盐析剂与脱水剂。本实验分别对比了NaCl与NaAc,无水MgSO₄与无水Na₂SO₄对各类兽药的回收率产生的影响。实验结果表明,当选用NaAc作为盐析剂时会不同程度地降低大环内酯类、磺胺类和四环素类兽药的回收率,分别由80% 、78%和77%降低至76% 、74%和64% ,这可能与NaAc溶解后会改变溶液的pH有关;当选用无水MgSO₄作为脱水剂时,四环素类兽药的平均回收率仅为25% ,这是因为四环素类兽药易与Mg²⁺形成螯合物^[22]。而当选用无水Na₂SO₄代替无水MgSO₄时,3种四环素类兽药的回收率均有明显提高,见图3。故本实验选用NaCl作为盐析剂,无水Na₂SO₄作为脱水剂。

图 3 不同脱水剂对四环素类兽药回收率的影响 Fig.3 Effect of different water adsorbents on the recoveries of tetracyclines

2.5 净化条件的优化

根据奶酪基质的特点,本实验比较了C₁₈、PSA和NH₂ 3种吸附剂的净化效果,3种填料均以硅胶为基质,分别键合C₁₈、N-丙基乙二胺和氨丙基。结果表明,NH₂吸附剂净化的奶酪样品重溶过膜后呈现出浑浊状态,多次测定容易对仪器造成污染。PSA对奶酪基质净化效果良好,然而极性较强的四环素类兽药回收率较低,仅为54% 。与PSA相比较,C₁₈主要吸附非极性物质,除脂效果较好,并且对四环素类兽药无明显吸附,四环素、大环内酯、喹诺酮和磺胺类兽药的回收率分别达到79% 、85% 、78%和79% 。由于C₁₈对多类兽药净化效果均较好,故选用C₁₈作为吸附剂。此外,实验进一步考察了C₁₈用量对50种兽药平均回收率的影响,结果表明,吸附剂的过量使用会吸附部分目标化合物,从而降低回收率;当C₁₈用量为200 mg时,平均回收率最高。

2.6 基质效应的评价

基质效应是由基质中的共提干扰物(非目标化合物)与目标化合物竞争电离所致^[23]。为评价基质效应,实验分别以两种不同脂肪含量(29%和52% )的奶酪空白样品制备添加含量为2、5、10、20、50、100、200、500 μ g/kg(大环内酯类兽药添加浓度减半)的基质标准曲线以及对应的溶剂标准曲线。根据两条基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值来评价不同脂肪含量奶酪基质效应的差异^[24]。若比值在0.8～1.2范围以内,则表明基质效应不明显。图4为本文检测的50种兽药在不同脂肪含量奶酪样品中基质效应的评价结果,可以看出,无论低脂肪含量的奶酪样品还是高脂肪含量的奶酪样品,80%以上的兽药基质效应不明显,仅有个别兽药呈现出了较强的基质效应,如泰妙菌素、环丙沙星等。此外,不同脂肪含量奶酪中50种兽药的基质效应分布基本保持一致。这说明对于不同脂肪含量的样品,目标化合物的基质效应差别并不明显,进一步说明了前处理方法可有效去除脂肪所引起的基质效应。尽管如此,为了更加准确的定量测定目标化合物,本实验仍采用空白基质匹配标准曲线来抵消或补偿基质效应。

图 4 不同脂肪含量奶酪样品中50种兽药基质效应分布 Fig.4 Distribution of matrix effects of the 50 drugs in cheese samples with different contents of fat For compound Nos.,see Table 1.

2.7 方法学验证

2.7.1 标准曲线、检出限与定量限

以空白样品制备添加含量为2、5、10、20、50、100、200和500 μ g/kg(大环内酯类兽药添加浓度减半)的基质标准曲线(以添加浓度为X轴,峰面积为Y轴),在选定的色谱和质谱条件下进行测定。线性相关系数(r²)≥0.995和r²≥0.999的比例分别为98%和92% 。采用逐级稀释法向空白样品中添加已知浓度的标准溶液,以3倍和10倍信噪比(S/N)分别计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。50种兽药的LOD和LOQ范围分别为0.02～6 μ g/kg 和0.05～20 μ g/kg。定量限在10 μ g/kg 以下(包含10 μ g/kg)的兽药占比为96% ,这说明该方法灵敏度较高,可满足奶酪中兽药残留检测的需求。50种兽药的线性范围、LOD和LOQ见表1。

2.7.2 回收率与精密度

在奶酪空白样品中进行20、50、100 μ g/kg 3个添加浓度下(大环内酯类兽药添加浓度减半)的回收率试验,每个浓度进行6个平行试验。3个水平下的回收率在70% ～120%范围的比例分别为94% 、92%和96% ,仅有少数兽药回收率偏低,如诺氟沙星(回收率低于70% );对方法的重复性进行了进一步的考察,结果发现在3个添加水平下,6个平行样品的相对标准偏差(RSD)均≤14%(见表1)。实验结果说明本方法的准确度和精密度良好,能够满足兽药残留定量检测的要求。

2.7.3 实际样品的测定

运用该方法对7例市售奶酪样品进行检测,基质匹配外标法定量。结果发现有两例样品分别检出了微量的罗红霉素和氟甲喹,但其浓度均低于方法定量限。

3 结论

本文结合奶酪基质特点和各类兽药的物理化学性质特点,开展了LC-MS/MS同时测定奶酪中4类50种兽药残留的分析方法研究。对奶酪中50种兽药提取、净化过程中的各种主要影响条件进行了评价与优化,有效地提高了方法效率;研究了不同奶酪产品对50种兽药残留检测的基质效应,保证了方法的准确可靠,并成功应用于市售奶酪样品的检测;本方法快速、简便、灵敏、准确,能够满足对奶酪样品中多类兽药残留快速检测的需求。

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