色谱  2015, Vol. 33 Issue (2): 169-173   PDF (792 KB)    
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黄小雅
钟园
黄忠平
金晨
王丽丽
潘再法
离子对反相高效液相色谱法同时测定尿液中复方α-酮酸片的5种有效成分
黄小雅, 钟园, 黄忠平, 金晨, 王丽丽, 潘再法     
浙江工业大学化学工程学院, 浙江 杭州 310014
收稿日期：2014-10-28
基金项目：浙江省自然科学基金项目(Y4110536).
通讯作者：潘再法,E-mail:panzaifa@zjut.edu.cn.
摘要：建立了同时测定尿液中复方 α -酮酸片5种有效成分(消旋羟蛋氨酸钙(HMACa)、酮缬氨酸钙(KVCa)、消旋酮异亮氨酸钙(KILCa)、酮亮氨酸钙(KLCa)和酮苯丙氨酸钙(KPACa))的离子对反相高效液相色谱法。分别考察了离子对试剂浓度、缓冲盐浓度和流动相pH值等参数对分离情况的影响。最终采用Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);以乙腈和含15 mmol/L四丁基氢氧化铵的20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min;柱温为35 ℃;检测波长为210 nm。在上述条件下,5种有效成分得到很好的分离,并且不受尿液中内源性基质的干扰,在20~200 mg/L范围内线性关系良好(r≥0.9990);HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa的检出限(S/N=3)分别为3.0、5.0、3.6、5.7和2.5 mg/L;定量限(S/N=10)分别为9.6、16.7、12.0、19.0和8.3 mg/L;日间、日内精密度均小于7%;平均回收率在86.79%~112.00%之间,RSD小于9%(n=5)。该方法准确,灵敏度高,重现性好,适用于尿液中这5种有效成分的检测。
关键词： 离子对反相高效液相色谱法     有效成分     尿液     复方 α -酮酸片    
Simultaneous determination of five active components of compound α -ketoacid tablet in human urine by ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography
HUANG Xiaoya, ZHONG Yuan, HUANG Zhongping, JIN Chen, WANG Lili, PAN Zaifa     
College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China
Received: 2014-10-28
Abstract: A simple and sensitive method for the simultaneous determination of five active components, D,L-α-hydroxymethionine calcium (HMACa), α -ketovaline calcium (KVCa), D, L-α-ketoisoleucine calcium (KILCa), α -ketoleucine calcium (KLCa) and α-ketophenylalanine calcium (KPACa) of compound α -ketoacid tablet in human urine by ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was developed and validated. The separation conditions, such as the concentration of ion-pair reagent, the pH value of the mobile phase and the concentration of the buffer were optimized. All the five analytes were separated well on a C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with diode array detection at 210 nm and the column temperature of 35 ℃. The mobile phases were acetonitrile and 20 mmol/L phosphate buffer (containing 15 mmol/L tetrabutylammonium hydroxide; pH 7) at the flow rate of 1.0 mL/min with gradient elution. The calibration curves for the five components were linear in the range from 20 to 200 mg/L (r≥0.9990). The limits of detection (LODs, S/N=3) were 3.0, 5.0, 3.6, 5.7 and 2.5 mg/L, and the limits of quantification (LOQs, S/N=10) were 9.6, 16.7, 12.0, 19.0 and 8.3 mg/L for HMACa, KVCa, KILCa, KLCa and KPACa, respectively. The intra-day and inter-day precisions were less than 7%, and the average recoveries were between 86.79% and 112.00% in the human urine with RSDs lower than 9% (n=5). The method proved precise, specific and reproducible, and can be used for the determination of the five components in urine.
Key words: ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)     active components     human urine     compound α -ketoacid tablet    

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)已成为主要的全球性健康问题,阻止其发展成为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)在临床和经济上有着重要意义[1]。长期蛋白尿是导致肾衰竭的重要危险元素[2]。近年来,许多学者认为合理食用低蛋白饮食(蛋白摄入量小于0.6 g/(kg·d))加服用复方 α -酮酸片是治疗CKD的重要方法之一[1, 3]。 α -酮酸为氨基酸的前体,与L-氨基酸可相互转换,在体内经转氨基作用转化为相对应的L-氨基酸,促进蛋白质合成,降低尿毒症毒素水平,改善继发性甲状旁腺亢进引起的一系列症状,并使患者保持良好的营养状况[4, 5]。同时,钙盐的补充可以有效改善肾性骨营养不良病人的免疫功能,对继发性甲亢也有积极的临床效果[6]。

复方 α -酮酸片为复方制剂,含4种酮代氨基酸钙(酮缬氨酸钙( α -ketovaline calcium,KVCa)、消旋酮异亮氨酸钙(D,L- α -ketoisoleucine calcium,KILCa)、酮亮氨酸钙( α -ketoleucine calcium,KLCa)、酮苯丙氨酸钙( α -ketophenylalanine calcium,KPACa)),1种羟代氨基酸钙(消旋羟蛋氨酸钙(D,L- α -hydroxymethionine calcium,HMACa))和5种氨基酸,是临床治疗慢性肾功能衰竭的新型药物。但是其成分复杂,而且以钙盐形式存在,因此很难应用普通的反相高效液相色谱法进行定量测定。

迄今为止,对复方 α -酮酸片中这5种氨基酸钙同时进行测定的方法并不多。已有的报道中,主要采用离子对高效液相色谱法(ion-pair HPLC)[6, 7]和离子排斥色谱法(IEC)[8]。但是对尿液等生物样品中这5种氨基酸钙盐的检测未见报道,因为尿液中存在的大量内源性基质,会对离子对高效液相色谱法分离这5种物质产生很大的干扰。因此,开发一种方便、准确的检测尿液中这5种氨基酸钙的方法具有一定的困难。然而检测方法的建立将对观察患者服用复方 α -酮酸片后的吸收、代谢情况具有重要意义,也可为临床治疗的服用剂量提供参考。此外,一些氨基酸代谢异常疾病也会使得尿液中某些 α -酮酸含量异常增加。比如因苯丙氨酸不能正常代谢,导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积而引起的苯丙酮尿(phenylketonuria,PKU)[9];以及因支链氨基酸形成相应的支链 α -酮酸后不能氧化脱羧,而导致支链 α -酮酸异常增高的枫糖尿症(maple syrup urine disease,MSUD)[10, 11]等。本文建立的方法可以为这些疾病患者的尿液样品诊断提供检测依据,从而为这些疾病的发现和治疗评价提供帮助。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与样品

高效液相色谱系统(美国Waters公司),配置Waters 1525二元高压泵、Waters 2998二极管阵列检测器和Breeze 2色谱工作站;Promax Syringe Filter滤膜(0.45 μ m); Eppendorf 5804高速离心机(德国Eppendorf公司); Hei-VAP Advantage旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。

四丁基氢氧化铵(tetrabutylammonium hydroxide,TBAH,含量为10%(以水为溶剂),上海紫一试剂厂),磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(分析纯,湖州湖试化学试剂有限公司),乙腈(色谱纯,天津四友精细化学品有限公司),实验用水(市售娃哈哈纯净水)。HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa标准品由浙江昂利康制药有限公司提供。空白尿液由健康志愿者提供。

复方 α -酮酸片购于药店,规格为630 mg/片,其中包含4种酮代氨基酸钙、1种羟代氨基酸钙和5种氨基酸,具体组成见表1。

表1 复方 α -酮酸片的组成成分 Table 1 Quantitative composition of a compound α -ketoacid tablet

1.2 标准溶液的配制

精密称取HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa标准品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中,用初始流动相溶解并定容,得到1 g/L 的单标准储备液,于4 ℃下避光保存。分别取1.5 mL上述储备液于10 mL容量瓶中,用初始流动相定容,得到150 mg/L 混合标准溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:乙腈(A)和20 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(含15 mmol/L TBAH,pH 7.0)(B);梯度洗脱程序:0～28.0 min,8%A～25%A,梯度曲线类型5; 28.0～37.0 min,25%A,保持9 min,梯度曲线类型6; 37.1～45.0 min,8%A,梯度曲线类型6。流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:210 nm;进样量:20 μ L。

1.4 尿液样品预处理

取8个10 mL具塞塑料离心管,各加入4 mL空白尿液和6 mL甲醇,混合振荡1 min,于 10000 r/min 下离心10 min,除去蛋白。将8个离心管的上层清液合并于250 mL圆底烧瓶中,于40 ℃旋转蒸发至近干,用初始流动相稀释至32 mL,避光于-18 ℃下保存备用。

用处理好的空白尿液稀释1 g/L 的标准储备液，得到质量浓度分别为20、40、70、100、150和200 mg/L 的基质加标溶液。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化

为了实现同时检测尿液中复方 α -酮酸片的5种有效成分,以1.4节中所配制的200 mg/L 基质加标溶液为样品,分别考察了离子对试剂浓度、流动相pH值和缓冲盐浓度对HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa色谱行为的影响。

由于实验中选择的检测波长为210 nm,与甲醇的截止波长接近,故选择乙腈作为有机溶剂。由于尿液基质较复杂,采用等度洗脱无法将这5种物质与尿液中的杂质分离,因此采用梯度洗脱。

2.1.1 离子对试剂浓度的影响

5种有效成分均呈弱酸性。分析酸性物质常用的离子对试剂有四丁基季铵盐、四丁基溴化铵等。本实验参考文献[6],选择四丁基氢氧化铵作为离子对试剂。流动相中离子对试剂的浓度对色谱峰的峰形影响较大。当离子对试剂浓度太低时,不能与待测物形成
较好的中性离子对;当其浓度过大时，会影响色谱柱和仪器的使用寿命。实验中考察了离子对试剂浓度分别为5、10和15 mmol/L 时对色谱分离行为的影响,结果见图1。可见,随着离子对浓度的增加,5种有效成分的保留时间逐渐延长,这符合离子对色谱的保留规律。离子对试剂浓度为5 mmol/L 时,峰2(KVCa)的分离度(Rs)为1.33,与前面的杂质峰部分重叠,影响定量分析,且各峰拖尾因子(T)较大;当浓度增加为10 mmol/L 时,色谱峰峰形均得到改善;而当浓度为15 mmol/L 时,5种物质与基质均能实现良好的分离,因此选择离子对试剂浓度为15 mmol/L。

图1 离子对试剂(TBAH)浓度对5种成分分离的影响 Fig.1 Effect of ion-pair reagent (TBAH) concentration on the separation of the five compounds Chromatographic conditions: mobile phases,acetonitrile (A) and 20 mmol/L phosphate buffer (containing different concentrations of tetrabutylammonium hydroxide (TBAH) as ion-pair reagent; pH 7) (B); flow rate,1.0 mL/min; gradient elution: 0-28.0 min,8%A-25%A,curve type 5; 28.0-37.0 min,25%A,hold 9 min,curve type 6; 37.1-45.0 min,8%A,curve type 6. Column,Waters Symmetry C18 (250 mm×4.6 mm,5 μ m); column temperature,35 ℃; injection volume,20 μ L; detection wavelength,210 nm.
Peak identifications: 1. HMACa; 2. KVCa; 3. KILCa; 4. KLCa; 5. KPACa.
2.1.2 流动相pH的影响

在离子对色谱中,对于酸性物质,随着流动相pH值变大,被分析物的解离程度越大,越容易和离子对试剂形成中性离子对,其保留值也越大;反之,保留值则越小。实验中考察了流动相pH值分别为3、5和7时对保留情况的影响。如图2所示,保留时间随流动相pH值的增加而增大,但总体变化不大。但在pH为3时,HMACa与KVCa峰未能与杂质峰完全分离,且KILCa未出峰或重叠,这可能是由于pH较低时,溶质离子解离不完全,没有与离子对试剂充分结合形成离子对,保留时间较短,因而未达到完全分离。pH为5时,各峰峰形较差,拖尾或前延较严重。另外，C18柱适宜的pH范围一般在2～8之间,过高的pH会损坏色谱柱,且pH变化较小时,各色谱峰变化不明显。综合考虑分离度及拖尾因子,本文选择流动相的pH为7。

图 2 流动相的pH值对5种成分分离的影响 Fig.2 Effect of pH of mobile phase on the separation of the five compounds Chromatographic conditions: TBAH concentration,15 mmol/L,other conditions are the same as in Fig. 1 except for different pH values.
Peak identifications are the same as in Fig. 1
2.1.3 缓冲溶液浓度的影响

固定其他条件不变,缓冲溶液浓度增大,流动相中离子强度增加,洗脱能力增强,保留时间缩短,但缓冲溶液浓度过高会影响色谱柱和仪器的使用寿命[12]。当缓冲溶液浓度由10 mmol/L 增加至50 mmol/L 时,色谱分离情况变化并不明显。考虑保留时间和分离度,实验选择缓冲溶液浓度为20 mmol/L。

兼顾目标分析物的保留时间、分离度、色谱峰峰形和对色谱柱的保护,选择了最佳的色谱条件(见1.3节)。

2.2 方法专属性考察

取混合标准溶液、空白尿液和基质加标溶液,在1.3节色谱条件下分别进行色谱分析,所得色谱图如图3所示。由图3可知,在此色谱条件下,HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa的保留时间分别为11.22、13.81、21.23、23.54和32.13 min,5种物质分离度良好,分析时间适中,尿液中的内源性物质不干扰测定。

图 3 (a)150 mg/L 混合标准溶液、(b)空白尿液、(c)200 mg/L 基质加标溶液的高效液相色谱图 Fig.3 HPLC chromatograms of (a) 150 mg/L standard solution,(b) a blank human urine sample and (c) a blank human urine sample spiked with 200 mg/L standards Peak identifications are the same as in Fig. 1
2.3 标准曲线及线性范围

在1.4节处理好的空白尿液中加入一系列不同体积的储备液,得到20、40、70、100、150和200 mg/L 的标准溶液,以峰面积y为纵坐标,以质量浓度x为横坐标进行线性回归,得到线性回归方程和线性范围见表2。结果表明,在20～200 mg/L 范围内,5种物质的线性关系良好(r≥0.9990)。

表 2 方法的线性方程、相关系数、检出限及定量限 Table 2 Linear equations,correlation coefficients (r), LODs and LOQs of the method
2.4 检出限与定量限

将10 mg/L 的标准溶液用空白尿液稀释成一系列不同浓度,分别取20 μ L进行液相色谱分析。以S/N=3确定检出限(LOD),S/N=10确定定量限(LOQ),各物质的LOD与LOQ见表2。

2.5 精密度

在处理好的空白尿液中加入不同体积的1 g/L 的标准储备液,得到20 mg/L 和100 mg/L 基质加标溶液,储存于4 ℃冰箱内。在同一天的不同时间
点平行测定5次,计算日内精密度,结果测定HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa的日内精密度(RSD)为1.42% ～6.61% ;在不同日期(连续3天)分别测定得到日间精密度,HMACa、KVCa、KILCa、KLCa和KPACa的日间精密度(RSD)为1.47% ～5.91% 。

2.6 稳定性

本实验考察了尿液样品溶液于-18 ℃冰箱保存,室温下解冻,反复冻融3次的稳定性,结果各物质的RSD均小于6% ,表明尿液中各物质在此条件下稳定性良好。

2.7 回收率

在处理好的空白尿液中加入不同体积的1 g/L 的储备液,得到20、100和200 mg/L 的尿液加标溶液。按1.3节的色谱条件进行检测,每个浓度水平进行5次平行测试,记录峰面积,代入回归方程计算各物质的浓度。以测得浓度与加入浓度之比计算回收率,结果见表3。

表 3 空白尿液中5种成分的添加回收率(n=5) Table 3 Recoveries of the five compounds spiked in a blank human urine sample (n=5)
3 结论

本研究建立的离子对反相高效液相色谱法实现了尿液中复方 α -酮酸片的5种有效成分的同时检测。本方法特异性强,精密度、准确度高,且样品预处理简单,内源性基质干扰小,为复方 α -酮酸片在人体内的吸收和代谢情况的研究提供了有效的检测方法。也可为苯丙酮尿症、枫糖尿症等小儿氨基酸代谢异常疾病患者尿液样品中的酮酸类物质检测提供参考。

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