液相色谱-串联质谱仪(LC-20A型液相色谱仪由日本岛津公司生产,AB5500型质谱仪由美国ABI公司生产),配有ESI源;高速均质器(德国IKA公司);氮吹仪(N-EVAP,美国Organomation公司);旋转蒸发器(德国IKA公司);高速离心机(美国贝克曼公司);旋混仪(德国IKA公司);固相萃取装置(SUPELCO公司)。

乙腈、甲醇、环己烷均为农残级试剂(Sigma公司);甲酸为色谱级(Sigma公司);无水硫酸钠(分析纯)于650 ℃灼烧4 h,贮于密封干燥器中备用。

吡虫啉、除虫脲、灭幼脲、多菌灵、啶虫脒、氟啶脲、辛硫磷、烯酰吗啉、咪鲜胺、苯醚甲环唑、嘧菌酯、噻虫嗪、敌百虫、阿维菌素、阿维菌素苯甲酸盐等农药标准品(纯度均≥98.0% ),均购于Sigma公司。

Sep-Pak Carb-NH₂复合固相萃取柱:1 000 mg/6 mL(Waters公司),使用前先用4 mL乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v)活化,弃去淋洗液,并在上样前保持柱体湿润;QuEChERS净化管(Waters公司)：含150 mg N-丙基乙二胺(PSA)和900 mg无水硫酸镁。

色谱柱:Phenomenex Synergi Fusion-RP C18 (50 mm×2.0 mm,2.5 μ m);流动相由含5 mmol/L 乙酸铵与0.1%(v/v)甲酸的水溶液(A)与含5 mmol/L 乙酸铵与0.1%甲酸(v/v)的甲醇溶液(B)组成。梯度洗脱程序:0～0.10 min,10%B; 0.10～2.00 min,10%B～50%B; 2.00～4.00 min,50%B～90%B; 4.00～8.00 min,90%B; 8.00～8.10 min,90%B～10%B; 8.10～10.00 min,10%B。流速:0.4 mL/min;进样量:5 μ L;柱温箱:40 ℃;分析时间:10 min。

离子源为ESI源,采用正离子多反应监测(MRM)扫描模式采集数据。以全扫描、子离子扫描等方式优化每种农药的母离子和子离子的强度。优化后的质谱分析条件:喷雾电压(IS)5 500 V;离子源温度(TEM)500 ℃;气帘气压力(Curtain gas): 2.1×10⁵ Pa;雾化气压力(Gas 1): 4.2×10⁵ Pa;辅助加热气(Gas 2): 4.2×10⁵ Pa;碰撞气(CAD): 6。离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等如表1所示。

分别准确称取适量的每种农药标准品,用丙酮分别配制成100.0 mg/L 的标准储备液;混合标准溶液,再根据需要用丙酮逐级稀释成0.20、1.0、5.0、10.0和50 μ g/L 的系列混合标准工作溶液。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 测定16种农药的质谱条件 Table 1 MS parameters for the determination of the 16 pesticides Compound Retention time/min Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Declustering potential/V Collision energy/V Collision cell exit potential/V Carbendazim 3.53 192.2 ([M+H]+) 160.2* 76 27 4 132.1 76 41 4 Acetamiprid 3.30 223.2 ([M+H]+) 126.1* 76 29 6 99.1 76 47 7 Imidacloprid 3.06 256.2 ([M+H]+) 209.0* 81 23 7 175.2 81 23 4 Trichlorfon 3.22 256.9 ([M+H]+) 109.1 86 25 6 127.0* 86 25 6 Phoxim 5.02 299.1 ([M+H]+) 129.1* 76 19 4 77.1 76 49 4 Diflubenzuron 4.85 311.0 ([M+H]+) 158.2* 66 19 6 141.2 66 47 6 Prochloraz 5.01 376.1 ([M+H]+) 308.0* 61 17 4 70.1 61 37 4 Dimethomorph 4.61 388.2 ([M+H]+) 301.1* 86 25 4 165.2 86 45 4 Chlorbenzuron 4.89 309.0 ([M+H]+) 156.0* 80 20 6 128.0 80 20 6 Thiamethoxam 2.62 292.0 ([M+H]+) 211.0* 91 17 4 181.0 91 31 4 Difenoconazole 5.05 406.2 ([M+H]+) 251.1* 96 37 6 408.2 ([M+H]+) 253.1 96 33 6 Azoxystrobin 4.51 404.1 ([M+H]+) 372.1* 71 19 4 344.1 71 27 4 Chlorfluazuron 5.50 540.0 ([M+H]+) 158.0* 111 27 6 383.0 111 27 6 Avermectin 5.68 876.5 ([M+NH4]+) 291.0* 81 35 6 145.0 81 43 6 Emamectin Bla 5.47 886.5 ([M+H]+) 158.6* 130 53 6 126.3 130 68 7 Emamectin Blb 5.36 872.5 ([M+H]+) 158.6* 163 53 4 126.3 163 72 4 * Quantitative ion.

表1 测定16种农药的质谱条件 Table 1 MS parameters for the determination of the 16 pesticides

称取25 g蔬菜样品,向其中加入50.0 mL的乙腈,高速匀浆2.0 min,在100 mL具塞量筒中加入5.0～7.5 g氯化钠,过滤匀浆好的样品,盖上塞子,剧烈振荡3 min,在室温下静置10 min分层,直至上层乙腈相与水相界面清晰。

QuEChERS净化步骤:取上清液3 mL,置于装有N-丙基乙二胺(PSA)填料150 mg、无水硫酸镁900 mg的净化离心管中,以 1 000 r/min 旋混2 min(或以手剧烈振荡提取1 min),离心后取上清液2 mL,用氮气吹至近干,残留物用1 mL甲醇溶解,再加入10 μ L 5%(v/v)甲酸乙腈溶液,混合均匀,用0.22 μ m滤膜过滤,上样至LC-MS/MS进行分析。

SPE净化步骤:取上清液10 mL至50 mL鸡心瓶后,用旋转蒸发仪在45 ℃条件下浓缩至近干,然后用2 mL乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v)溶液洗涤鸡心瓶,重复一次,合并洗涤液,上样至已活化好的Carb-NH₂固相萃取柱上,并接收流出液,然后用20 mL乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v)溶液淋洗固相萃取柱,接收全部洗脱液,浓缩近干后的残留物用5 mL甲醇溶解,再加入250 μ L 5%(v/v)甲酸-乙腈溶液,混合均匀,用0.22 μ m滤膜过滤,上样至LC-MS/MS进行分析。

采用LC-MS/MS法进行农药多残留分析时,现行有效的方法多采用C18色谱柱(例如XB C18、EC-C18、Fusion-RP C18),也有以高强度硅胶为基体键合C18固定相色谱柱(例如SB-C18、HSS T3色谱柱)，还有适用于强极性碱性化合物分析的亲水作用色谱柱(HILIC)；常用的流动相为甲醇-乙酸铵溶液体系、乙腈-0.1%(v/v)甲酸体系和含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液与含0.1%(v/v)甲酸、5 mmol/L 乙酸铵的水溶液等体系。本研究根据所分析的17种化合物的性质,对XB C18(50 mm×2.0 mm,2.6 μ m)、Fusion-RP C18(50 mm×2.0 mm,2.5 μ m)和SB-C18(50 mm×2.0 mm,2.7 μ m)等3种色谱柱的分离效果进行了比较,同时也对乙腈-0.1%(v/v)甲酸、甲醇-乙酸铵溶液以及含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液与0.1%(v/v)甲酸-5mmol/L 乙酸铵的水溶液等不同流动相进行了比较。最终确定采用Fusion-RP C18为分析色谱柱,以含5 mmol/L 乙酸铵与0.1%(v/v)甲酸的水溶液(A)与含5 mmol/L 乙酸铵与0.1%甲酸(v/v)的甲醇溶液(B)为流动相。

实验表明,流动相中含有少量的甲酸和乙酸铵可以促进吡虫啉、多菌灵等化合物的电离,采用甲醇作为流动相也能使阿维菌素等化合物形成稳定的加NH₄⁺峰,在梯度洗脱条件下通过Fusion-RP C18色谱柱可得到较好分离。图1为LC-MS/MS分析16种农药的MRM色谱图。

图1

Fig. 1

图1 16种农药标准品的MRM色谱图 Fig.1 MRM chromatograms of the 16 pesticide standards

对于果蔬中农药残留的提取,目前主要采用的方式为均质提取、振荡提取和快速溶剂萃取等,提取溶剂大多采用乙腈、甲醇、丙酮等单一溶剂或者乙腈-水、丙酮-正己烷(1 ∶ 2,v/v)、丙酮-二氯甲烷(1 ∶ 1,v/v)等混合溶剂。本研究为了保证提取效率,根据分析物的化学性质,分别采用乙腈、甲醇和丙酮-环己烷(1 ∶ 2,v/v)为提取溶剂进行均质提取,提取后的上清液经QuEChERS净化后通过LC-MS/MS分析,得到不同提取溶剂的回收率结果(见图2)。

图2

Fig. 2

图2 不同溶剂的提取效率 Fig.2 Extraction efficiencies of different solvents

采用甲醇作为提取溶剂时,由于其极性较强,在液液萃取时与水相亲和力较大,导致绝大部分农药不能完全萃取到有机相中,回收率在20% ～60%之间;而用丙酮-环己烷(1 ∶ 2,v/v)作为提取溶剂时,吡虫啉、多菌灵、啶虫脒和敌百虫则几乎没有回收,主要可能由于这些农药的极性较强、水溶性好,不能完全被萃取至极性较弱的溶剂体系中;采用乙腈作为提取溶剂时,由于被测农药在其中都有较好的溶解性,并在均质时对样品基质有较强的穿透力,从而能够获得较高的回收率。因此,确定乙腈为16种农药的提取溶剂。

由于蔬菜、水果等样品基质中含有较多的有机酸、糖类物质、维生素以及脂肪等,这些物质在提取过程中会随被测农药一齐被提取出来。如果不进一步净化,基质效应带来的干扰会影响检测结果的准确性。本研究对SPE与QuEChERS两种净化技术进行了比较。

采用Carb-NH₂ SPE进行净化时,关键是要确定其淋洗曲线,了解被测农药在净化柱上的保留情况,进而可以获得较好的净化及检测结果。考察淋洗曲线时,将提取液浓缩后,用乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v)溶解上样,再用乙腈-甲苯(3 ∶ 1,v/v)洗脱,每2 mL接收一次洗脱液,当洗脱液体积至16 mL时,16种农药的回收率均能达到98%以上,Carb-NH₂ SPE柱的淋洗曲线见图3。

图3

Fig. 3

图3 16种农药在Carb-NH2固相萃取柱上的农药洗脱曲线图 Fig.3 Elution curves of Carb-NH2 for the 16 pesticides

采用QuEChERS净化时,将3 mL提取液直接加入到含有PSA 150 mg、无水硫酸镁900 mg的净化离心管中净化,经离心、浓缩处理后再进样至LC-MS分析。

对上述两种不同的净化方式进行比较,通过实验结果可以看出,两种方式都能够得到较好的回收率(＞75% )。但相对于QuEChERS,SPE净化时存在样品处理时间较长、步骤较为繁琐及溶剂消耗量较大等问题。因此,最终采用QuEChERS作为16种农药多残留快速筛查的净化方法。

在优化的条件下进行了方法学考察。配制16种农药的基质匹配标准溶液,质量浓度分别为0.2、1.0、5.0、10.0、50.0 μ g/L,进样5 μ L,以MRM定量离子的色谱峰面积(Y)对分析物质量浓度(X,μ g/L)建立标准曲线,以3倍信噪比(S/N)确定检出限(LOD),结果见表2。在线性范围内,各组分的峰面积与质量浓度成良好的线性关系,相关系数大于0.995。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 17种农药的线性回归方程、线性范围、相关系数(r)及检出限(LOD) Table 2 Linear regression equations,linear ranges,correlation coefficients (r) and LODs of the 17 pesticides Compound Regression equation Linear range/(μg/L) r LOD/(μg/kg) Carbendazim Y=18981X+30892 0.20-50 0.9991 0.20 Acetamiprid Y=98028X+49662 0.50-50 0.9993 0.24 Imidacloprid Y=23285X+26441 1.0-50 0.9999 0.57 Trichlorfon Y=24896X+10451 2.5-50 0.9989 2.2 Phoxim Y=34983X-36379 2.0-50 0.9971 1.5 Diflubenzuron Y=49495X-29277 1.0-50 0.9991 0.78 Prochloraz Y=76727X-20970 5.0-50 0.9985 3.0 Dimethomorph Y=12714X-11659 5.0-50 0.9998 2.6 Chlorbenzuron Y=23288X-41229 1.0-50 0.9982 0.57 Thiamethoxam Y=18439X+61672 5.0-50 0.9999 4.7 Difenoconazole Y=75492X-14046 5.0-50 0.9974 2.5 Azoxystrobin Y=20603X+45487 5.0-50 0.9999 3.6 Chlorfluazuron Y=54507X+9000 5.0-50 0.9992 1.8 Avermectin Y=18981X+30892 5.0-50 0.9990 4.9 Emamectin Bla Y=35232X+45201 5.0-50 0.9995 3.7 Emamectin Blb Y=46560X+15127 5.0-50 0.9960 3.5 Y: peak area; X: mass concentration,μ g/L.

表2 17种农药的线性回归方程、线性范围、相关系数(r)及检出限(LOD) Table 2 Linear regression equations,linear ranges,correlation coefficients (r) and LODs of the 17 pesticides

本方法采用标准加入法,取已制备均匀的空白样品,准确加入16种农药的混合标准溶液,制备加标水平分别为5、10、20 μ g/kg 的样品各5份,按上述优化后的方法提取、净化样品,并进行LC-MS/MS分析,基质匹配外标法定量,计算平均回收率和精密度。结果所有农药的回收率均在75% ~111%之间,精密度均小于16%(见表3)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 3个加标水平下的农药回收率及精密度(n=5) Table 3 Recoveries and repeatabilities of the pesticides spiked at three levels (n=5) Compound 5 μg/kg Recovery/% RSD/% 10 μg/kg Recovery/% RSD/% 20 μg/kg Recovery/% RSD/% Carbendazim 102.2 4.5 91.8 3.4 83.2 4.2 Acetamiprid 97.5 2.8 100.4 6.1 101.6 3.4 Imidacloprid 96.5 2.8 95.9 2.7 98.8 4.1 Trichlorfon 94.5 6.4 94.2 1.5 97.9 6.1 Phoxim 89.6 7.9 100.8 4.1 105.7 3.6 Diflubenzuron 87.0 15.7 98.7 9.3 76.6 1.9 Prochloraz 97.5 4.6 112.3 7.6 100.2 4.1 Dimethomorph 90.6 10.6 99.4 2.4 103.9 4.4 Chlorbenzuron 97.5 2.8 101.0 5.9 94.9 3.6 Thiamethoxam 91.2 9.2 88.3 7.1 98.7 7.7 Difenoconazole 83.2 13.0 84.4 9.8 82.6 10.4 Azoxystrobin 83.7 9.2 86.0 7.1 83.0 8.6 Chlorfluazuron 88.2 12.5 79.4 9.3 83.5 8.5 Avermectin 83.0 11.6 88.3 12.2 85.0 7.3 Emamectin Bla 93.6 7.6 82.0 4.2 83.2 5.9 Emamectin Blb 80.9 11.4 85.5 10.6 88.6 6.2

表3 3个加标水平下的农药回收率及精密度(n=5) Table 3 Recoveries and repeatabilities of the pesticides spiked at three levels (n=5)s