随着现代生活节奏的加快、生活压力的增大,越来越多的人受到失眠症的困扰[1]。镇静催眠药是一类通过抑制中枢神经系统而缓解过度兴奋和引起近似生理睡眠的药物,对中枢神经系统的抑制作用随着剂量增加而加深,使用镇静催眠药更易发生不良反应,这类药物具有潜在的依赖性,长期使用可产生耐受性,以及身体和心理依赖性[2]。目前中国国家食品药品监督管理局批准上市的宣称具有改善睡眠作用的保健食品中,大部分产品以褪黑素为原料,还有一部分产品的原料是具有安神作用的中药材,如刺五加、酸枣仁、柏子仁、远志、天麻、合欢皮、夜交藤、珍珠等[3]。相比西药,保健食品的副作用相对较小,但是起效缓慢、个体差异较大。某些生产厂家为了谋取利益,利用保健品成分复杂、质量标准不完善等监管漏洞,在保健食品中非法添加镇静催眠化学药品以提高其产品的疗效,欺骗消费者。建立保健食品中非法添加镇静催眠药品的快速检测方法对防止和打击此类不法行为、保障人民健康具有极为重要的意义。
目前对这类药物的分析检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[4, 5]、高效液相色谱法(HPLC)[6]、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[7, 8, 9, 10, 11, 12]等。在各类基质中这类药品的检测均有报道,包括血液[4, 8, 12]、尿液[8]、饲料[7]、食品[10]、中成药[11]及保健食品[5, 6, 9, 11]等,其中已报道的保健食品中非法添加镇静催眠药品局限在苯二氮卓类、巴比妥类等精神药品的检测研究方面,未涉及一些生物源性和植物源性成分;且这些研究多采用三重四极杆质谱建立的定量分析方法,对目标化合物的定性分析和质谱裂解规律并无涉及,不利于定性判定是否非法添加[5, 6, 9],已不能满足市场监管要求。随着医药行业的发展,更多的化学药物用于失眠症的治疗,生产企业也会选择添加尚未被监测的、更加复杂的生物源性、植物源性活性成分。建立专属性强、灵敏度高、快速、准确,能同时检测几十种镇静催眠药品的分析方法势在必行。本研究收集了临床上具有镇定催眠效果的24种药物,建立了可以对其同时检测和确证的高效液相色谱-离子阱质谱(HPLC-IT MS)快速筛查方法,并对其质谱裂解规律进行了探讨,为保健食品中非法添加化学药品的监管提供了有力的工具。
Agilent 1100高效液相色谱仪,MSD Trap离子阱质谱仪,配电喷雾离子(ESI)源(美国Agilent公司); KH-250DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器公司生产); Centrifuge 5424 R型离心机(德国Eppendorf公司);甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯(美国Sigma公司);实验用水为Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)制备;XP6型微量电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。
宣称具有改善睡眠功能的保健食品样品来自于 2014 国家保健食品安全风险监测抽样。
24种镇静催眠药对照品:马来酸咪达唑仑(批号 171250-201002,纯度99.9% )、艾司唑仑(批号 171219-201003,纯度99.7% )、阿普唑仑(批号 171218-201104,纯度99.1% )、三唑仑(批号 171230-201203,纯度99.6% )、氯氮卓(批号 171248-200702,纯度99.7% )、硝西泮(批号 171217-200402,纯度100.0% )、奥沙西泮(批号 171229-201104,纯度100.0% )地西泮(批号 171225-201304,纯度99.9% )、劳拉西泮(批号 171253-201102,纯度99.2% )、酒石酸唑吡坦(批号 171258-200601,纯度100.0% )、氯硝西泮(批号 171227-201103,纯度100.0% )、巴比妥(批号 171220-200602,纯度100.0% )、苯巴比妥(批号 171222-200605,纯度100.0% )、异戊巴比妥(批号 171221-201203,纯度99.9% )、司可巴比妥(批号 9201,纯度100% ,国家麻醉品实验室)、戊巴比妥(批号 20140221,纯度98% ,美国SIGMA公司)、氯美扎酮(批号GL01-KQFT,纯度98.0% ,日本TCI公司)、褪黑素(批号 80717,纯度99.50% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司)、佐匹克隆(批号 100870-200801,纯度99.9% )、马来酸氯苯那敏(批号 100047-200606,纯度99.7% )、扎来普隆(批号 100670-200401,纯度100.0% )、盐酸文拉法辛(批号 100543-200401,纯度100.0% )、青藤碱(批号 110774-200507,纯度100.0% )、罗通定(批号 100452-200301,纯度100.0% )。未标明来源的对照品均来自中国食品药品检定研究院。
色谱条件:色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(150 mm×2.0 mm,3 μ m);流动相A为0.05%(v/v)甲酸水溶液,流动相B为甲醇-乙腈(15 ∶ 25,v/v)溶液,流动相A与流动相B按体积比60 ∶ 40等度洗脱25 min;流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样体积:10 μ L。
质谱条件:电喷雾电离正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)切换;雾化器压力:2.62×105 Pa;干燥气流速:10 L/min;干燥气温度:350 ℃;裂解电压:1.20 V;扫描MS1～MS3三级质谱。典型对照品(佐匹克隆)标准溶液的MS1～MS3谱图见图1,24种镇静催眠药品的定性特征离子见表1。
精密称取适量的上述24种药品对照品,以甲醇为溶剂,分别制备成质量浓度为1 g/L 的单标准对照品储备液,于-20 ℃冰箱中保存。
分别精密量取上述24种单标准对照品储备液适量,置于50 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,制备成含马来酸咪达唑仑、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、氯氮卓、硝西泮、奥沙西泮、地西泮、酒石酸唑吡坦均为2 mg/L,劳拉西泮20 mg/L 的混合对照品储备液A;含氯硝西泮10 mg/L,巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥100 mg/L,异戊巴比妥130 mg/L 的混合储备液B;只含戊巴比妥100 mg/L 的对照品储备液C;含褪黑素12 mg/L,佐匹克隆46 mg/L,马来酸氯苯那敏14 mg/L,扎来普隆84 mg/L,盐酸文拉法辛和罗通定3 mg/L,青藤碱5 mg/L,氯美扎酮179 mg/L 的混合对照品储备液D。
以不含目标化合物的胶囊和口服液样品为空白基质,分别精密量取上述混合对照品储备液A 1.0 mL至5、10、15、20、25、50 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,制备成含马来酸咪达唑仑、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、氯氮卓、硝西泮、奥沙西泮、地西泮、酒石酸唑吡坦质量浓度范围为0.04～0.4 mg/L,劳拉西泮浓度范围为0.4～4.4 mg/L 的基质系列对照品溶液。
以不含目标化合物的胶囊和口服液样品为空白基质,分别精密量取上述混合对照品储备液B 1.0 mL至10、20、50、100、200 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,制备成含氯硝西泮质量浓度范围为0.05～1 mg/L,巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥质量浓度范围为0.5～10 mg/L,异戊巴比妥质量浓度范围为0.6～13 mg/L 的基质系列对照品溶液。戊巴比妥对照品储备液C同法配制,制备成含戊巴比妥0.5～10 mg/L 的基质系列对照品溶液。
以不含目标化合物的胶囊和口服液样品为空白基质,分别精密量取上述混合对照品储备液D 0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mL至20 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,制备成含褪黑素质量浓度范围为0.3～12 mg/L,佐匹克隆质量浓度范围为1～46 mg/L,马来酸氯苯那敏质量浓度范围为0.3～14 mg/L,扎来普隆质量浓度范围为2～84 mg/L,盐酸文拉法辛和罗通定质量浓度范围为0.06～3 mg/L,青藤碱质量浓度范围为0.1～5 mg/L,氯美扎酮质量浓度范围为4～179 mg/L 的基质系列对照品溶液。
取供试品(软胶囊、硬胶囊、片剂、口服液),准确称量(固体制剂取一次口服剂量,液体制剂精密量取15.0 mL),置于50 mL容量瓶中,加甲醇约40 mL,超声提取20 min,放至室温,加甲醇定容至刻度,摇匀,经0.45 μ m滤膜过滤,滤液用甲醇-水(1 ∶ 1,v/v)溶液稀释3倍后进行HPLC-IT MS测定。
首先利用流动注射的方式对24种待测化合物的裂解电压进行了优化,设定裂解电压的30%至200%作为梯升裂解电压,此处设定的裂解电压为1.0 V,梯升电压0.3 V升至2.0 V,从单独的母离子产生MS2谱,重复此过程,由MS2中分离得到的母离子(基峰离子)裂解生成MS3谱。为了使多数待测化合物获得良好的离子化效率,及产生子离子的技术可重现,选择裂解电压为1.2 V。
为了获得良好的分离效果和离子化效率,本实验对流动相进行了优化。分别比较了甲醇和乙腈作为有机相,水、乙酸和甲酸作为水相的分离效果。结果将甲醇和乙腈按15 ∶ 25的体积比混合作为有机相的分离效果最好。水相中加入甲酸，多个化合物的拖尾峰形得到明显的改善,响应值增大;甲酸浓度过高，响应降低。最终将流动相确定为甲醇-乙腈(15 ∶ 25,v/v)作有机相,0.05%(v/v)甲酸水溶液作水相,等度洗脱分离。
本实验中24种目标化合物于甲醇中均有较好的溶解度,故选择不同浓度的甲醇水溶液作提取溶剂,比较其提取效果。结果表明:甲醇浓度越高对目标化合物的提取效率越高,对于大多数保健品，以100%甲醇提取后,滤液比较洁净,无需进一步净化,简化了样品前处理过程,最终确定以甲醇为提取液,为了提高离子化效率,滤液再用甲醇-水(1 ∶ 1,v/v)溶液稀释。
将上述1.3节中含基质的系列对照品溶液经0.45 μ m滤膜过滤,滤液按1.2节条件测定,以其质量浓度为横坐标,对MS1谱中提取母离子色谱(EIC)峰峰面积作线性回归。结果表明:24种镇静催眠药品在1.3节中各自质量浓度范围内线性关系良好(r2＞0.999)。
取系列对照品溶液质量浓度最低点溶液,用甲醇倍比稀释后测定,以信噪比约为3时对应的各对照品溶液浓度为检出限,各目标药物的检出限结果见表2。
以不含目标化合物的胶囊和口服液样品为空白基质进行加标回收率测定,低、中、高3个添加水平分别为各系列对照品溶液中最低浓度点的1/2浓度点、系列对照品溶液中的最低浓度点、系列对照品溶液中间浓度点。平行测定6次以评价该方法的准确度,所得到的平均加标回收率和相对标准偏差(RSD)见表2。
为了利用MS2、MS3谱定性分析样品,必须得到重现的子离子谱图。为此,本实验考察了不同天测定同一浓度目标化合物的MS2、MS3谱,MS2谱中的基峰离子完全可以重现,MS3谱中的子离子至少可以重现一个,定性结果符合欧盟非强制执行法案 2002-657-EC质谱分析方法4分鉴定点数要求[13]:低分辨质谱至少需要一个母离子(1分)和两个子离子(1.5分)定性。
分别按1.4节的方法处理27批样品,按1.2节的方法测定。先扫描MS1和MS2谱,如果样品中存在与目标化合物对照品保留时间一致的色谱峰、与目标化合物对照品相一致的MS1谱中的母离子和MS2谱中的至少一个子离子,然后再扫描其MS3谱;若出现至少一个与目标化合物对照品的MS3谱相一致的子离子,则判为阳性样品,或者存在与目标化合物标准谱图相一致的MS1谱的母离子和MS2谱的两个子离子,也判为阳性样品。样品测定结果:27批宣称改善睡眠类的保健食品中18批样品检出褪黑素,其配方原料中均注明有褪黑素,因此不属于非法添加。典型样品的MS1~MS3谱图如图2所示。
实验发现苯二氮卓类药物的准分子离子峰附近常出现m/z相差2,且丰度比约为3 ∶ 1(含有Cl元素的典型同位素峰)的离子峰,且常产生脱氯断裂的碎片峰(m/z相差35或者37)。这是由于苯二氮卓类药物多含有Cl元素,可以根据碎片离子是否还有m/z相差2的离子峰判断碎片结构中是否还有Cl元素。苯二氮卓类药物含有1,4-苯并二氮卓结构,若二氮卓环上有-NCH3的侧链,会发生脱N断裂,由七元环变为八元环,并发生进一步断裂,生成稳定的五元环或者六元环。若含有羰基结构还会发生酰胺的相关断裂。对苯二氮卓类药物的质谱碎片裂解途径进行推测，具体如图3所示。
根据巴比妥药物的分子式可知,巴比妥为丙二酰脲衍生物。在电喷雾负离子模式下,该类分子式结构可能发生了[M-H]-→[M-H-CHON]-断裂,裂解路径如图4所示。根据此裂解规律,可对实测目标分析物进行确证分析。
其他镇静催眠类药物,包括氯美扎酮、褪黑素、佐匹克隆、马来酸氯苯那敏、扎来普隆、盐酸文拉法辛、青藤碱、罗通定,结构中都含有N原子或者酰胺结构,因此会发生相关断裂,其质谱裂解路径如图5所示。
离子阱质谱图包含与分子总体结构的较小部分相关的子离子质量信息,所以离子阱质谱具有最高的全扫描MS2采集灵敏度,其碎片离子谱被认为是分子的“指纹谱图”;另一方面,离子阱对于母离子的裂解选择性更好,MS2谱中的子离子是直接由母离子产生的,裂解后对子离子进一步分离裂解产生MS3子离子,所以离子阱产生的子离子谱图比其他仪器更清楚,MS3子离子化的步骤提高了对母离子结构的专属性,使得离子阱成为结构解析的独特仪器。因此,利用MS2、MS3谱子离子定性,灵敏度更高、专属性更强,得到更多的化合物裂解信息和规律。根据此裂解规律,可对实测目标化合物进行确证分析。
本文建立了HPLC-IT MS检测保健品食中非法添加24种镇静催眠药的快速筛查方法,从实际样品的检测结果来看,本方法专属性强、灵敏度高,适用于保健品中非法添加镇静催眠药品的定性确证,为控制保健品质量、打击保健食品行业非法添加行为提供了有效的工具。
2015, Vol. 33 Issue (3): 256-266
PDF (1075 KB)
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