色谱  2015, Vol. 33 Issue (2): 152-157   PDF (1047 KB)    
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欧婉露
李玉娟
石冬冬
屈锋
非水毛细管电泳法测定藤黄中藤黄酸的含量
欧婉露1, 李玉娟1, 石冬冬2, 屈锋1     
1. 北京理工大学生命学院, 北京 100081;
2. 中国农业科学院饲料研究所, 北京 100081
收稿日期：2014-11-5
基金项目：国家重点基础研究发展计划项目("973"项目)(2012CB910603);国家自然科学基金项目(21175011,21375008,81202996).
通讯作者：屈锋, E-mail: qufengqu@bit.edu.cn
摘要：藤黄酸(gambogic acid, GA)等环氧杂蒽酮类化合物的水溶性差,可通过非水毛细管电泳(non-aqueous capillary electrophoresis, NACE)分析。本文系统地考察了添加20%~60%(v/v)的甲醇或乙腈的运行电解质溶液对藤黄提取液中藤黄酸分离的影响。比较了不同的运行电解质溶液、运行电解质溶液浓度、pH、添加剂 β-环糊精的浓度、分离温度及分离电压的影响,建立了测定藤黄药材中藤黄酸含量的非水毛细管电泳方法。在40%乙腈、10 mmol/L β-环糊精、20 mmol/L四硼酸钠(pH 9.86)为运行电解质溶液、分离电压为10 kV、分离温度为30 ℃、检测波长为280 nm的条件下进行测定。结果表明,藤黄酸在2~2000 mg/L范围内线性关系良好,相关系数为0.9996,检出限(S/N=3)为2 mg/L。将本方法应用于越南、泰国、缅甸、印度4个产地的藤黄药材中藤黄酸的含量测定,测得含量为1.67~472.40 mg/g(相对标准偏差(RSD)为1.12%~2.60%),其中越南产藤黄中藤黄酸含量低,其他产地藤黄中藤黄酸的含量高。实际藤黄样品中藤黄酸的加标回收率为95.2%~105.6%。非水毛细管电泳方法简单、快速、重现性好,可用于藤黄药材中藤黄酸的含量测定。
关键词： 非水毛细管电泳     藤黄酸     藤黄    
Determination of gambogic acid in Gamboge by non-aqueous capillary electrophoresis
OU Wanlu1, LI Yujuan1, SHI Dongdong2, QU Feng1     
1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;
2. Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Received: 2014-11-5
Abstract: Gambogic acid (GA), a kind of caged xanthones, has low solubility in water. A non-aqueous capillary electrophoresis (NACE) was established for the determination of GA in Gamboge based on the optimized conditions. The effect of 20%-60% methanol or acetonitrile spiked in running solution was investigated. The effects of compositions, concentration, pH, additives like β-cyclodextrin in running buffer were thoroughly studied. Applied voltage and applied temperature were also observed. Optimal electrophoretic conditions were as follows: 20 mmol/L sodium borohydride solution (pH 9.86) containing 40% (v/v) acetonitrile, 10 mmol/L β-cyclodextrin as running buffer, applied voltage of 10 kV, capillary temperature of 30 ℃ and detection wavelength of 280 nm. The calibration curve had good linearity in the range of 2-2000 mg/L with the correlation coefficient of 0.9996. The limit of quantification (S/N=3) of the method was 2 mg/L. The quantifications of GA in Gamboge from different producing places including Vietnam, Thailand, Burma, India were 1.67-472.40 mg/g with the RSD (n=3) of 1.12%-2.60%. The content of Gamboge from Vietnam is obviously low while the others are high. The recoveries of GA spiked in real samples ranged from 95.2% to 105.6%. The method of NACE is simple, efficient and of good reproducibility, can be served as a novel reference to identify and control the quality of Gamboge.
Key words: non-aqueous capillary electrophoresis (NACE)     gambogic acid     Gamboge    

藤黄(Gamboge)为藤黄科植物藤黄树分泌的干树脂,性寒,味酸、辛、涩,有毒,具有破血散结、解毒、止血、杀虫的功效。藤黄作为中药可治疗瘰疬、痈疸、疖肿[1]。文献报道不同属藤黄的树脂所含化学成分明显不同,例如G. morella的树脂中含有异藤黄宁、藤黄酸(gambogic acid,GA)和异藤黄酸。G. hanburyi的树脂中则含有脱氧藤黄宁、异藤黄宁、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄醛等几十种化合物[2]。GA是藤黄中具有抗癌作用的有效成分之一,属环氧杂蒽酮类化合物[3](见图1)。文献报道的GA测定方法主要有液相色谱-质谱联用法[4, 5]、液相色谱-紫外检测法[6]、薄层扫描法[7]和ZrOCl2比色法[8]。

毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是高效、快速、微量的分析方法,广泛用于生物碱类、多酚类、糖类、脂类、萜类等成分分析[9, 10]。利用CE分析氧杂蒽酮类药物已有报道[11, 12],研究表明在运行电解质溶液中加入 β -环糊精可以改善这类化合物的分离效果[13]。GA(环氧杂蒽酮)与氧杂蒽酮虽具有相同母核,但GA有突出于环平面的桥结构,且水溶性差,因此不能用常规的CE进行分析。目前,基于CE分析环氧杂蒽酮的方法还未见报道。采用非水毛细管电泳(non-aqueous capillary electrophoresis,NACE),在硼砂运行电解质溶液中加入一定比例的有机溶剂,再加入手性添加剂 β -环糊精，则可对环氧杂蒽酮进行分析。本文考察了NACE运行缓冲液中添加不同比例的甲醇或乙腈以及不同浓度的 β -环糊精对GA分析的影响,优化了GA的分析条件,并将该方法用于4个产地的藤黄药材中GA的含量测定。

图1 藤黄酸的分子结构 Fig.1 Molecular structure of gambogic acid
1 实验部分
1.1 主要仪器和试剂

Beckman P/ACETM MDQ毛细管电泳仪,配备紫外(UV)检测器(Beckman,美国)。熔融石英毛细管(有效长度/总长为40 cm/50.2 cm,内径75 μ m),购自凯利奥拉色谱分析(河北邯郸)有限公司。

藤黄酸对照品由辽宁大学药学院陈烨老师提供,纯度为97.3% 。4种藤黄药材购自安徽亳州,所标产地分别是越南、泰国、缅甸、印度,由北京理工大学生命学院吕芳博士鉴定为藤黄的干树脂。

氢氧化钠(NaOH)、十水合四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)、硼酸(H3BO3)、乙醇均为分析纯(北京化工厂); β -环糊精( β -cyclodextrin,β -CD)(北京奥博星生物技术有限公司);甲醇(CH3OH)、乙腈(CH3CN)均为色谱纯(Fisher Scientific公司,美国);实验用水为蒸馏水。

1.2 藤黄酸对照品溶液的配制

准确称取藤黄酸对照品25.00 mg，置于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制 5 000 mg/L 的藤黄酸对照品储备液。根据需要用甲醇逐级稀释，配制成不同浓度的藤黄酸工作溶液。

1.3 藤黄药材的提取

将藤黄药材用粉碎机粉碎后,每种药材精密称重约10.00 g,加入100 mL 95%(v/v)乙醇浸泡1 h,然后加热回流提取1 h,收集滤液。残渣中加入80 mL 95%乙醇,加热回流提取1 h,收集滤液。合并两次滤液,抽滤,减压蒸馏至近干。残渣用少量甲醇溶解后转移至10 mL容量瓶中,并用甲醇定容,于4 ℃下保存,供分析。

1.4 毛细管电泳条件

以40%(v/v)乙腈、10 mmol/L β -环糊精、20 mmol/L 四硼酸钠为运行电解质溶液,用NaOH溶液调节pH至9.86,使用前经0.45 μ m滤膜过滤。分离电压为10 kV,分离温度为30 ℃,检测波长为280 nm,进样压力为5 kPa,进样时间为5 s。

新毛细管在使用前分别用1 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L NaOH溶液、H2O各冲洗30 min。两次实验进样间用0.1 mol/L NaOH溶液、H2O、运行电解质溶液各冲洗3 min。毛细管超过24 h不用时,需两端水封于室温下保存。

图2 运行电解质溶液中添加的有机溶剂类型及其比例对藤黄酸电泳行为的影响 Fig.2 Effects of organic solvent type and their ratios spiked in the running buffer on (a,b) the separation and (c) effective mobility of GA Organic solvents: a. CH3OH; b. CH3CN. Conditions: running buffer,12 mmol/L Na2B4O7; applied voltage,15 kV; temperature,30 ℃; detection wavelength,280 nm; injection,5 kPa×5 s.
2 结果与讨论
2.1 运行电解质中添加有机溶剂种类及其比例的影响

在12 mmol/L 硼砂溶液中添加不同体积分数(20%～60% )的甲醇或乙腈,考察对藤黄酸分离的影响，结果见图2a和2b。增加甲醇或乙腈的比例,GA的迁移时间明显增加。

以甲醇的溶剂峰为中性标记物,考察有机溶剂比例对GA的有效迁移率的影响(见图2c)。可见甲醇或乙腈溶剂的比例增加,影响GA的有效迁移率(其数值代表迁移快慢,负值表示藤黄酸的电泳方向与电渗流方向相反)。乙腈的比例增加,GA的有效迁移率呈明显降低。当有机溶剂的比例低于20%时,GA不出峰;高于60%时,有硼砂析出。由于甲醇和乙腈的比例相同时,甲醇溶液的黏度明显大于乙腈溶液的黏度(20% 、40% 、60%的甲醇水溶液的黏度分别为1.40、1.62、1.54; 20% 、40% 、60%的乙腈水溶液的黏度分别为0.98、0.89、0.72[14])，因此GA在添加乙腈的运行电解质中的电渗流较添加甲醇时大。添加30% ～40%的甲醇或乙腈时,GA的峰形好,分析时间短。综合考虑峰形和分析时间,选择在运行电解质溶液中添加40%的乙腈。

2.2 β -环糊精浓度的优化

手性筛分介质 β -CD可以显著改善结构相似的氧杂蒽酮类化合物的分辨率[13]。氧杂蒽酮上的酚羟基、羰基、羧基与 β -环糊精或硫酸化 β -环糊精上的多羟基产生氢键作用[11, 12]。运行电解质中不含 β -CD时,藤黄提取液呈簇峰,无法确定藤黄酸的峰,即使对缓冲液类型、浓度、pH等实验条件进行优化也未能改善藤黄提取液中各组分的分离。但在运行电解质溶液中加入2～14 mmol/L 的 β -CD,可使藤黄提取液中各组分明显分离(见图3)。但 β -CD浓度大于10 mmol/L 时容易析出,电泳过程中易出现电流断流现象。故在运行电解质溶液中加入10 mmol/L的 β -CD。

图3 β -CD浓度对分离的影响 Fig.3 Effect of β-CD concentration on the separation Conditions: 40% acetonitrile,other conditions referring to Fig.2.
2.3 运行电解质溶液条件的优化

在不同的运行电解质溶液中添加40%乙腈和10 mmol/L β -CD,在此条件下考察运行电解质溶液的其他条件对藤黄提取液分离的影响。

2.3.1 运行电解质溶液种类的选择

分别考察了以硼砂盐溶液、磷酸盐、Gly-NaOH、Tris-HCl缓冲液为运行电解质溶液对分离的影响。由图4a可见,在磷酸盐、Gly-NaOH、Tris-HCl缓冲液中,藤黄提取液中各组分几乎未分离,而在硼砂盐溶液中,各组分分离度高,峰形尖锐。故选择硼砂溶液作为运行电解质溶液。

2.3.2 运行电解质溶液浓度的选择

考察了4～24 mmol/L的Na2B4O7缓冲液对GA分离的影响。由图4b可见，随着硼砂盐浓度的增加,离子强度增加,电渗流降低,藤黄提取液中各组分的迁移时间增加,分离度也明显增加。当Na2B4O7浓度为24 mmol/L 时,毛细管电泳产生的电流为40 μ A,焦耳热较大,易产生气泡。当Na2B4O7浓度为20 mmol/L 时,各组分的分离度良好。故选择运行电解质溶液浓度为20 mmol/L。

2.3.3 运行电解质溶液pH的选择

GA的pKa为7.8[1]，运行电解质溶液的pH有可能影响GA的羧基解离。用NaOH溶液或HCl溶液调节20 mmol/L Na2B4O7缓冲液(含40%乙腈、10 mmol/L β -CD)的pH值。当pH为7.86～9.36时,pH对藤黄提取液分离的影响不大,电泳谱图呈现相似的簇峰,仅迁移时间略有变化,但GA峰被簇峰掩盖,无法确认。而pH为9.86时,簇峰的迁移时间明显增加,其中的GA峰可确认。用NaOH溶液进一步调高pH值,导致电流增大,峰形明显展宽。故选择运行电解质溶液的pH为9.86。

图4 运行电解质溶液的(a)种类、(b)Na2B4O7缓冲液浓度和(c)运行电解质溶液的pH对分离的影响 Fig.4 Effects of (a) running buffer type,(b) Na2B4O7 buffer concentration and (c) pH of running buffer on the separation Conditions: a. different running buffers containing 10 mmol/L β -CD,40% CH3CN,other conditions referring to Fig. 2. b. Other conditions referring to Fig. 4a except for Na2B4O7 buffer. c. 20 mmol/L Na2B4O7 buffer,other conditions referring to Fig. 4b.
2.4 分离电压对分离的影响

分离电压会影响分离速度和多组分间的分离度。当分离电压为30 kV时,电泳分离过程中产生的焦耳热高,运行电解质溶液容易产生气泡,电泳过程的电流不稳定,基线噪声大。当分离电压为25 kV时,藤黄提取液中多组分出峰非常密集,分离度不高,影响对GA的识别。随着分离电压的降低,分离度有所改善。分离电压为10 kV时,藤黄提取液中多组分有较高的分离度(见图5a),故选择分离电压为10 kV。

2.5 分离温度对分离的影响

增加电泳分离温度有利于增加 β -CD和藤黄提取液中组分的溶解度。分离温度为20 ℃时,β -CD容易析出,造成毛细管堵塞。分离温度为35 ℃时,运行电解质溶液容易产生气泡,电泳过程中出现电流断流现象。图5b比较了25 ℃和30 ℃对分离的影响。两种温度下,分离效果差异不大,但温度影响 β -CD的溶解度(25 ℃时,β -CD在水中的溶解度为18.5 g/L(16.3 mmol/L)),考虑到 β -CD在40%CH3CN中的溶解度更低，为了避免电泳过程中 β -CD析出,选择分离温度为30 ℃。

图5 (a)电压和(b)温度对藤黄提取液分离的影响 Fig.5 Effects of (a) voltage and (b) temperature on the separation of extract of a Gamboge sample Conditions: a. 40% CH3CN,10 mmol/L β -CD,20 mmol/L Na2B4O7 buffer (pH 9.86) as running buffer; temperature,30 ℃. b. applied voltage,15 kV; other conditions referring to Fig. 5a except for temperature.
2.6 工作曲线、检出限和方法的精密度

对质量浓度分别为2、10、50、100、500、1 000、2 000 mg/L 的藤黄酸对照品按1.4节的电泳条件进行测定,以藤黄酸峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归,藤黄酸在2～2 000 mg/L 范围内，线性方程为A=3 126.7C+32 721,相关系数r=0.999 6。以响应值3倍于基线噪声所对应的浓度作为检出限,藤黄酸的检出限为2 mg/L。对质量浓度为100 mg/L 的藤黄酸对照品溶液测定6次,计算GA的峰面积和迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为1.31%和0.43% 。

2.7 实际样品和添加回收率的测定

利用本文建立的方法对产自越南、泰国、缅甸、印度的藤黄药材进行测定。由图6a可见，按照1.3节方法处理后,越南产的藤黄提取液的电泳谱图组分最复杂，GA峰最小；而在泰国、缅甸、印度产的藤黄电泳图中均可明显检测到GA峰,且基本无杂峰。对将泰国产的藤黄提取液稀释10倍后仍可检测到 GA峰(见图6b)。另外，将印度产的藤黄药材粉 末直接经甲醇溶解、过滤、稀释 (样品质量浓度约为 1×10-3 g/mL),未经1.3节方法前处理,其电泳谱图(见图6c)与泰国产的藤黄提取液的谱图相似,显示印度产的藤黄中GA含量较高。

图6 (a)不同产地的藤黄提取液、(b)稀释10倍的泰国产藤黄提取液和(c)未经提取处理的印度产藤黄粉末甲醇溶解液的电泳图 Fig.6 Electropherograms of (a) the extracts of Gamboge from different producing places,(b) the extract of Gamboge from Thailand diluted by 10 ∶ 1 and (c) Gamboge powder from Indian dissolved in methanol directly (1×10-3 g/mL) without the extraction Conditions: running buffer,40% CH3CN,10 mmol/L β -CD,20 mmol/L Na2B4O7 buffer (pH 9.86); temperature,30 ℃; applied voltage,10 kV; detection wavelength,280 nm; injection,5 kPa×5 s.

分别称取4个产地的藤黄样品各9份,平均分为3组,每组样品中分别添加原含量的50% 、100% 、150%的藤黄酸对照品粉末,按照建立的方法进行提取和测定,考察藤黄样品中藤黄酸的加标回收率(见表1)。4个样品中藤黄酸含量测定结果的RSD均在3%以内,加标回收率在95.2% ～105.6%之间。

表1 不同产地藤黄中藤黄酸的含量及其加标回收率(n=3) Table 1 Contents and recoveries of gambogic acid in Gamboge from different producing places (n=3)
3 结论

藤黄酸的水溶性差,采用CE不能将其分离。本文以40%乙腈、10 mmol/L β -环糊精、20 mmol/L 四硼酸钠(pH 9.86)为运行电解质溶液，利用NACE成功分离了藤黄提取液中的藤黄酸。采用该方法测定了产自越南、泰国、缅甸、印度的藤黄药材，其中藤黄酸的含量分别为1.67、249.96、472.40、328.90 mg/g。该结果表明,不同产地的藤黄中GA的含量差异明显,这可能与药材产地的植物生长气候和地理环境以及采收季节等有关。

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