双三元液相色谱(DGLC)系统(Thermo Fisher,USA),配置包括6通道真空脱气机SRD3600、双梯度分析型色谱泵(DGP3600)、自动进样器(WPS3000TSL)、二极管阵列检测器(DAD3000)、柱温箱(TCC-3000,配有一个2位置六通阀和一个2位置10通阀)、Acclaim 120 C8色谱柱(100 mm×2.1 mm,3 μ m)和Accucore Polar Premium色谱柱(C18柱)(150 mm×3.0 mm,2.6 μ m)、变色龙色谱管理软件(Chromeleon 7.2 SR1)。

维生素D₃(纯度≥95% ,HPLC级)和维生素D₂ (纯度≥95% ,HPLC级)均由中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用;维生素A(all-trans retinol,纯度＞95% )购自Acros Organics公司;维生素E(纯度≥96% ,HPLC级)购自Sigma公司。KOH(分析纯)和抗坏血酸(纯度≥95% ,分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司;乙腈、甲醇(色谱级)购自Fisher公司;去离子水(18.2 M Ω \5cm)由Millipore纯水机制得;婴幼儿配方奶粉和液态乳品由蒙牛乳业提供。

参考国家标准方法(GB 5413.9-2010)^[5],精密称取奶粉10 g(液态奶50 g)于250 mL锥形瓶中,加入30 mL热水溶解(液态奶不需加入)后,再依次加入100 mL 15 g/L 的维生素C乙醇溶液、25 mL 1.25 kg/L KOH溶液和1.0 mL 10 mg/L 维生素D₂内标溶液,磁力搅拌45 min,温度53 ℃。之后将皂化液转移至500 mL分液漏斗中,以石油醚萃取3次,每次用100 mL石油醚,然后用水洗涤3～5次合并后的萃取液至中性(pH试纸测试),收集石油醚层,经过无水硫酸钠脱水干燥。最后低温减压回收石油醚至萃取液剩余1～2 mL时转移至10 mL棕色瓶中,氮气吹干,以3～5 mL甲醇溶解后转移至10 mL容量瓶中,用甲醇稀释定容,摇匀,放入4 ℃冰箱中保存待用。

以甲醇溶解维生素A、D₂、D₃和E标准品制成4种维生素的混合标准储备液,质量浓度分别为1.24、1.00、1.00和2.06 g/L。再用甲醇将上述混合标准储备液稀释100倍后备用。

DGLC系统的左泵作为一维分析泵,以C8柱为一维分析柱,梯度洗脱,流速0.4 mL/min;以DGLC的右泵作为二维分析泵,以C18柱为二维分析柱,梯度洗脱,流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,流动相均为乙腈(A)、甲醇(B)和水(C);检测波长分别设为263 nm (维生素D₃)、296 nm (维生素E)和325 nm (维生素A);进样体积10 μ L;收集定量环(loop环)的体积为500 μ L。系统流路连接见图1,梯度洗脱程序及阀切换时间见表1和表2。

图1

Fig. 1

图1 全自动在线二维柱切换系统流路示意图 Fig.1 Flow scheme of fully-automated online two-dimensional column switching system

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 一维分离和二维分离的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient programs of the two-dimensional separation The first dimensional analysis Time/min φ(A)/% φ(B)/% φ(C)/% The second dimensional analysis Time/min φ(A)/% φ(B)/% φ(C)/% 0 50 0 50 0 10 0 90 2 50 0 50 17 10 0 90 15 100 0 0 19 100 0 0 20 0 100 0 25 60 40 0 27 50 50 0 29 60 40 0 28 50 0 50 30 0 100 0 A: acetonitrile; B: methanol; C: water.

表1 一维分离和二维分离的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient programs of the two-dimensional separation

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 阀切换时间及过程 Table 2 Times and processes of valve switching Time/min Left valve in Fig. 1 Right valve in Fig. 1 Description 0.00 6_1 2_1 quantification of vitamins A,E and purification of vitamin D3 (VD3) through connecting 1-D column with a UV detector 15.75 6_1 10_1 The target including VD3 from 1-D column is transferred into the loop 16.20 6_1 2_1 takeing elute stored in the loop into 2-D column 19.00 1_2 10_1 quantification of VD3 through connecting 2-D column with the UV detector 30.00 6_1 2_1 switching to the initial mode

表2 阀切换时间及过程 Table 2 Times and processes of valve switching

本文在前期研究^[12]中,建立了婴幼儿配方奶粉中维生素A、D₃和E的全自动二维分离系统,但该方法存在以下缺点:一是由于一维和二维色谱柱的串联,在将目标馏分从一维色谱柱直接转移至二维色谱柱时系统压力会骤然升高,对色谱柱造成损伤;二是每次分析都需校正维生素D₃在一维色谱中的保留时间,以重新确认切割时间窗口,否则会造成目标物在切割过程中损失。针对以上问题,本文对系统流路进行了优化:首先采用500 μ L定量环收集一维目标馏分,避免切换过程中系统压力的骤然变化;另一方面在定量环中预先填充高比例水相的溶剂,可以稀释一维分离中的流动相,减少了溶剂效应。二是将二极管阵列检测器置于收集馏分的定量环之前,这样可根据维生素D₃在一维色谱柱中的出峰时间随时调整切割时间窗口,保证目标物能100%地从一维色谱柱切割至二维色谱柱中。如图2所示,0～20 min为一维分离过程,其中高浓度的维生素D₃(5.0 mg/L)出峰时间窗口仅为0.3 min,为保证目标物全部切割至二维色谱柱中,将时间适当调宽为15.75～16.20 min,切割时间窗口为0.45 min。另外,可以根据保留时间的变化,灵活设定右阀的切换时间,以保证目标物在切割过程中无损失。优化后的系统流路可实现在第一维色谱柱上进行维生素A和E的定量及维生素D₃的净化,在第二维色谱柱上进行维生素D₃的定量分析。整个过程在密闭系统内自动化完成。

图2

Fig. 2

图2 维生素A、D2、D3、E混合标准溶液的(a)二维分离色谱图和(b)20～30 min第二维分离的放大谱图 Fig.2 (a) Two-dimensional chromatograms and (b) the second dimensional enlarged chromatograms from 20 to 30 min of the mixed standard solution of VA,VD2,VD3 and VE

一维分离机理和二维分离机理保持最大差异性或正交性是构建良好二维分离体系的关键。在我国现行标准方法中,正相色谱的分离净化结合反相色谱的定量分析,是正交性较好的“离线二维”分离过程,但实现正相色谱和反相色谱在线二维分离十分困难。目前多采用微柱^{[13, 14]}或在线蒸发接口技术^[15],虽然可解决溶剂兼容性问题,并减小正相色谱流动相对反相分离的溶剂效应,但对于常规样品的检测分析,还不具有普遍实用性。因此本文在一维和二维分离中均采用以疏水保留为主的反相色谱分离模式,一维为C8柱,二维为极性嵌合的反相色谱柱,根据Snyder等^[16]的疏水减法模型,两根色谱柱的正交因子(F_s)为65,满足正交分离的条件,可作为正交色谱柱使用。由于C8柱对脂溶性物质的保留较C18柱弱,因此一维分析可以选择洗脱能力相对“较弱”的流动相,即可将维生素D₃从一维转移至二维色谱柱中,从而减少溶剂效应的影响;另外，在色谱柱规格选择上,一维分离选择窄径柱有助于“压缩”谱峰,减小目标馏分的洗脱体积,从而减小溶剂效应。

图2为4种维生素混合标准溶液的二维分离图。从0～20 min的一维谱图可以看出,维生素A和E分离较好,可满足测定要求,说明C8柱可以兼顾维生素A和E的分离;另外,维生素D₂和D₃在一维C8色谱柱中未被分离,二者保留时间相同,被“压缩”成了一个峰,因此缩小了一维的切割时间窗口,这样既减小了对二维分离的溶剂效应,又可避免过多基质成分因窗口过大切割进入二维色谱柱中而造成干扰;在20～30 min的二维分离中，维生素D₃的色谱峰对称因子为1.05,对称性较好,维生素D₂和D₃的分离度为2.16,达到了基线分离。另取婴幼儿配方奶粉样品,按照1.2节方法制备样品溶液,进样分析。从图3婴幼儿配方奶粉样品分离谱图可以看出，4种维生素分离较好，其中维生素D₃色谱峰在峰顶点、前沿和后沿50%处的紫外吸收光谱图较均匀一致，可判断维生素D3色谱峰的纯度较好,样品基质无干扰,方法专属性较好。

图3

Fig. 3

图3 婴幼儿配方奶粉样品中4种维生素的(a)二维分析谱图和(b)20～30 min的二维分离放大图谱 Fig.3 (a) Two-dimensional chromatograms and (b) the second dimensional enlarged chromatograms from 20 to 30 min of the four vitamins in an infant formula sample

GB 5413.9-2010^[5]采用外标法测定婴幼儿配方营养品中维生素D的含量,由于维生素D的绝对回收率较低,需要用回收率对每批的测定结果进行校正。但在实际分析中,每个样品的回收率不可能一致,因此会导致最终的测定结果重现性较差。本文参考欧洲食品标准^[8],采用内标法定量。维生素D₂和D₃是维生素D的主要活性化合物,二者均为开环甾体类化合物,结构相似,理化性质相近,因此可互为内标物。另外,本文采用反相色谱法分离,可以将维生素D₂和D₃基线分离,维生素D₂可以校正样品在皂化及萃取等前处理过程中维生素D₃的损失,提高方法的准确度。从图4可以看出维生素D₂和D₃在二维色谱柱中分离较好,且没有样品基质干扰,表明了内标法的可行性。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 婴幼儿配方奶粉样品中维生素A和E的加标回收率(n=3) Table 3 Recoveries of vitamins A and E spiked in a infant formula sample (n=3) Analyte Background/(μg/g) Spiked level/(μg/g) Found/(μg/g) Recovery/% RSD/% Vitamin A 0.8843 0.6200 1.4652 93.7 2.45 1.2400 1.1309 91.2 1.96 1.8600 1.9288 103.7 2.04 Vitamin E 28.0000 10.3000 37.5151 92.3 3.44 20.6000 46.7954 89.2 1.84 30.9000 56.9224 95.6 1.22

表3 婴幼儿配方奶粉样品中维生素A和E的加标回收率(n=3) Table 3 Recoveries of vitamins A and E spiked in a infant formula sample (n=3)

图4

Fig. 4

图4 (a)VD2和VD3混合标准溶液、(b)加VD2内标的样品溶液和(c)未加VD2的样品溶液的谱图 Fig.4 Chromatograms of (a) a mixed standard solution of VD2 and VD3,(b) a sample solution spiked with VD2 as internal standard and (c) a sample solution without VD2

分别精密量取维生素D₃、A和E的混合标准溶液适量,置于不同的10 mL棕色量瓶中,配成系列浓度的混合标准溶液,再分别精密加入1.0 mL质量浓度为10 mg/L 的维生素D₂作内标,进样10 μ L。以质量浓度为横坐标,维生素D₃与维生素D₂的峰面积比值为纵坐标，维生素A和E均以峰面积为纵坐标,做线性回归。结果发现,维生素D₃在0.02～5.0 mg/L 范围内的相关系数r为 0.999 6，维生素A在0.62~124 mg/L范围内的相关系数r为0.999 1，维生素 E在0.824～1 030 mg/L范围内的相关系数r为0.997 8,表明各目标物线性关系良好。按S/N=10确定目标物的定量限，维生素D₃的定量限为0.015 mg/L,维生素的定量限为0.040 mg/L；维生素E的定量限为0.339 mg/L。

取0.1 mg/L 的混合标准溶液连续进样6次,计算得到维生素D₃、A和E峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.0% 、0.93%和1.01% 。结果表明该方法在连续进样时精密度较好。

精密称取婴幼儿配方奶粉和液态奶样品,其中固体样品每份10 g,液体样品50 g,分别加入适量的维生素A、维生素D₃和维生素E标准品(见表3和表4),按照1.2节所述方法制备样品溶液,测定3种维生素的含量,计算回收率。结果显示,维生素D₃的加标回收率为75.50% ～85.00% 。维生素A的加标回收率为91.2% ～103.7% ;维生素E的加标回收率为89.2% ～95.6% 。

采用本法随机测定了婴幼儿、学生、中老年配方奶粉,奶酪和酸奶等强化乳品中维生素A、D₃和E的含量,并与我国现行标准分析方法(GB 5413.9-2010)^[5]的测定结果进行对比,结果见表5,其中维生素D₃的对比结果见图5。采用配对t检验法对数据结果进行了统计学分析,t检验表明差异无统计学意义,可认为两种方法对维生素A、D₃和E的测定结果基本一致。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 样品中维生素D3的含量及其加标回收率(n=3) Table 4 Contents and spiked recoveries of vitamin D3 in samples (n=3) Sample type Sample No. Spiked/(μg/g) Background/(μg/g) Found/(μg/g) Recovery/% RSD/% Milk 1 0.0756 0 0.0610 80.05 2.11 2 0.0732 0 0.0564 77.05 2.06 3 0.0954 0 0.0776 81.00 1.46 4 0.0234 0 0.0191 81.97 2.47 5 0.0585 0 0.0468 80.00 1.78 Milk power 1 0.2440 0.0578 0.2420 75.50 3.90 2 0.4480 0.0566 0.4240 82.00 2.82 3 0.3740 0.069 0.3570 77.00 2.19 4 0.2000 0.075 0.2390 82.00 3.12 Cheese 1 0.4150 0.0856 0.4300 83.00 4.40 2 0.1194 0.0715 0.1730 85.00 4.45

表4 样品中维生素D3的含量及其加标回收率(n=3) Table 4 Contents and spiked recoveries of vitamin D3 in samples (n=3)

图5

Fig. 5

图5 采用本法与标准方法(GB 5413.9-2010)测定样品中维生素D3含量的结果对比 Fig.5 Result comparison of vitamin D3 in samples using this method and the standard method (GB 5413.9-2010) CMF: children fortified milk; ECF: early childhood formula; AMF: adult milk powder; SMF: student milk powder; IF: infant formula; FC: fortified cheese; BM: breakfast milk.

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 两种方法测定样品中维生素A和E的含量 Table 5 Contents of vitamins A and E in different samples with the two methods Sample name No. VA/(μg/g) Present method GB 5413.9- 2010 VE/(μg/g) Present method GB 5413.9- 2010 CMF 1 0.9 0.789 29.1 29.9 2 0.868 0.769 27.2 29.1 3 0.885 0.791 28.4 29.2 ECF 1 5.432 5.063 96.7 80.7 2 5.555 5.039 88.3 80.9 FC 1 4.113 4.222 ND ND 2 3.586 3.925 ND ND 3 4.018 4.142 ND ND 4 4.012 4.149 ND ND 5 4.114 4.513 ND ND ND: not detected.

表5 两种方法测定样品中维生素A和E的含量 Table 5 Contents of vitamins A and E in different samples with the two methods