LKCE 7200型毛细管电泳仪(天津兰力科公司),毛细管(河北永年光导纤维厂),光纤(南京春辉公司),470 nm、480 nm波长发光二极管(深圳世锋科技有限公司),0.45 μ m微孔滤膜(天津贺世科技有限公司)。FITC(Sigma公司),硼砂、氢氧化钠(天津化学试剂厂),以上试剂均为分析纯。毛细管电泳平台装置的简图见图1。

图1

Fig. 1

图1 毛细管电泳-发光二极管诱导荧光检测平台 Fig.1 Schematic diagram of capillary electrophoresis with light emitting diode-induced fluorescence (CE-LED-IF) detection platform 1. separation capillary; 2. detection window; 3. lens; 4. LED; 5. bandpass filter; 6. buffer reservoirs; 7. Pt electrodes; 8. PC (personal computer); 9. optical fiber.

本文采用的CE-LED-IF有别于CE-LIF,以LED作为光源,并将外径50 μ m的光纤插入到长度53 cm(有效长度50 cm)、内径75 μ m毛细管中，通过光纤,LED的光线被直接导入到毛细管的检测窗口以激发荧光,较之CE-LIF中激光光源的正交激发模式,减少了光线在毛细管壁上的反射与散射,提高了CE-LED-IF的灵敏度^{[ 19 ]}。

20例正常体检人群的血清由天津兰力科公司提供,20例肝硬化患者的血清由天津市第二人民医院提供,共40例样本。所有血清均用10 mmol/L 硼砂溶液稀释40倍,制成待衍生血清,置于-20 ℃冰箱中保存。

用电泳缓冲液配制1 mg/mL 的FITC,于4 ℃避光保存,备用。将50 μ L待衍生血清加入2 mL样本瓶中,再加入600 μ L 1 mg/mL 的FITC溶液,于4 ℃避光衍生过夜,得到待测样品。

毛细管总长度53 cm,有效长度50 cm;电动进样,进样电压20 kV,进样时间10 s;电泳缓冲液10 mmol/L 硼砂缓冲液,pH 9.6;电泳电压20 kV;滤光片为500～540 nm带通滤光片;光源是中心波长为470 nm的LED。

所有样品上机测试前均超声脱气,用0.45 μ m微孔滤膜过滤。溶液配制过程中均使用重蒸水。

FITC的最佳激发和发射波长是490 nm和520 nm。根据FITC的这一特性,检测时用滤光片滤除光源的光线,这样就消除了光源对有用光信号的干扰。如图2所示,对比了470 nm、480 nm的LED与滤光片、FITC发射谱的光谱。470 nm LED的光谱与滤光片光谱重合面积较小,即光源的光对有用信号的干扰较小。因此选用中心波长为470 nm的LED作为光源。

图2

Fig. 2

图2 (a)470 nm和(b)480 nm的LED与滤光片、FITC 发射光的光谱 Fig.2 Emission spectra of (a) 470 nm and (b) 480 nm LED,FITC and spectra of filter

选择硼砂溶液作为电泳缓冲液,考察了5、10、15、20 mmol/L 硼砂缓冲溶液(pH 9.6)对血清蛋白质分离的影响,每个浓度条件下对同一正常人血清样本进行10次检测。发现浓度为5 mmol/L 时,只检测到少量蛋白质峰且重复性差;20 mmol/L 时,电泳检测时间大大延长且电流不稳定;10 mmol/L 和15 mmol/L 时,蛋白质的迁移时间随着缓冲溶液浓度的增大而增加(见图3)。究其原因,是缓冲溶液浓度增大时,溶液的离子强度增大,导致电渗流(EOF)降低。EOF是毛细管电泳的主要动力,EOF降低导致蛋白质迁移时间增加。在硼砂缓冲液浓度为10 mmol/L 的条件下,蛋白质间分离度和峰形均较好,检测时间较短。因此本文选择10 mmol/L 的硼砂溶液作为电泳缓冲液。

图3

Fig. 3

图3 (a)15 mmol/L 和(b)10 mmol/L 硼砂缓冲溶液 (pH 9.6)条件下血清蛋白质的电泳谱图 Fig.3 Serum protein electropherograms with (a)15 mmol/L and (b)10 mmol/L borax buffer solution (pH 9.6)

电泳分离电压会直接影响血清蛋白质的迁移时间。电泳分离电压上升,蛋白质的电迁移时间降低,可以缩短检测分析时间;但是过高的分离电压,一方面可能使血清蛋白质未能较好地分离就通过检测窗,另一方面会产生过多的焦耳热,可能使峰变宽,影响电泳的分辨率和重复性。实验对比了18、20、22 kV 3个电泳分离电压对血清蛋白质分离的影响,其结果如图4所示。18 kV时的结果与其他两个分离电压的结果相比较,有一部分蛋白质未被检测到;22 kV时,因电压较高,产生过多的焦耳热,导致电泳电流不稳定,影响电泳分离分析的重复性;20 kV时,蛋白质分离效果最佳,不会因电压过低而使分析时间延长,也不会因为过高的电压而导致过多的焦耳热产生。因此本文选择20 kV电压作为电泳检测的分离电压。

图4

Fig. 4

图4 不同电泳分离电压下的血清蛋白质的电泳谱图 Fig.4 Serum protein electropherograms under different separation voltages a. 18 kV; b. 20 kV; c and d. 22 kV.

毛细管电泳中,pH值对EOF的影响较大,pH的改变会引起组分的迁移时间及样品峰值的改变,是毛细管电泳中检测结果重复性的关键。实验考察了缓冲液的pH值的影响。在碱性环境中,血清蛋白质都带负电荷,可进行毛细管区带电泳分离,所以本文选择了pH分别为9.2、9.4、9.6、9.8的硼砂电泳缓冲液作为分离考察的研究对象。电泳分离的样品为FITC标记的正常人血清蛋白质,其在4种pH下的电泳分离情况如图5所示。可以发现,随着缓冲溶液pH的升高,蛋白质的分离度也逐步提高。图5a中,最后3个蛋白质群与其他pH值时的峰形差异较大:峰展宽,峰值低且分离度不高。这是由于蛋白质在毛细管内壁上的吸附作用使得峰形展宽。蛋白质在毛细管内壁的吸附问题一直是毛细管电泳检测蛋白质的难点,一般采用极限pH值法可以改善蛋白质的吸附问题。对比发现,随着电泳缓冲液pH的提高,图5圈内各个蛋白质峰之间的距离也相应增大,说明缓冲液pH的增大使得圈内各个蛋白质峰的分离度提高;图5d的分离度较图5c提高,但是其电泳的时间也更长。综上所述,pH为9.6时蛋白质峰形、分离度和保留时间都较为理想。因此,本文选择pH值为9.6的硼砂溶液(10 mmol/L)作为电泳缓冲液。

图5

Fig. 5

图5 不同pH值硼砂缓冲液(10 mmol/L)条件下血清蛋白质的电泳谱图 Fig.5 Serum protein electropherograms with 10 mmol/L borax buffer solution of different pH values a. pH 9.2; b. pH 9.4; c. pH 9.6; d. pH 9.8.

在最优化的条件下,对2.5×10^-3mg/mL FITC溶液进行10次检测,以考察CE-LED-IF检测的重复性。FITC的迁移时间和峰面积的RSD分别是1.14%和3.23% ,均小于5% ,说明CE-LED-IF检测具有良好的重复性。

在最优化的条件下,对20例正常人血清及20例肝硬化患者血清进行CE-LED-IF检测。代表性的电泳谱图如图6所示。

图6

Fig. 6

图6 (a)正常人和(b)肝硬化患者血清蛋白质的电泳谱图 Fig.6 Selectropherograms of serum proteins of (a) normal people and (b) patients with cirrhosis Peak Nos. are the same as in Table 1.

使用OriginPro 9.0软件寻峰并计算各个峰的相对峰面积,FITC的峰面积不计入峰总面积,两组数据间采用独立样本t检验,结果见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 40例正常人和肝硬化患者血清蛋白质的 相对峰面积(n=20) Table 1 Relative peak areas of serum proteins of 40 cases of normal people and patients with cirrhosis (n=20) Protein peak Average±SD/% Normal Cirrhosis 1 27.34±3.13 29.20±2.86 2 7.27±0.57 6.99±2.95 3 1.73±0.35 2.87±0.57* 4 - 0.98±0.29* 5 4.61±0.24 4.23±0.13* 6 3.33±0.18 2.73±0.21* 7 2.46±0.43 0.69±0.33* 8 - 0.65±0.31* 9 0.71±0.16 0.71±0.21 10 26.91±4.53 26.14±3.98 11 8.10±0.35 9.13±0.24* 12 6.28±0.87 7.01±0.76* 13 11.26±2.83 8.60±1.27* -: not detected. * p＜0.05.

表1 40例正常人和肝硬化患者血清蛋白质的 相对峰面积(n=20) Table 1 Relative peak areas of serum proteins of 40 cases of normal people and patients with cirrhosis (n=20)

由表1可知,肝硬化患者的血清蛋白质比正常人的多检测到2个蛋白质峰(4号和8号),可能与肝硬化的发生相关;3、11、12号峰的含量较之正常人有所升高;5、6、7、13号峰的含量较之正常人有所降低;且以上几个蛋白质峰的差异有统计学意义,即p＜0.05。

CE-LED-IF可以检测出正常人和肝硬化患者血清之间的差异性。但是,CE-LED-IF无法对检测到的蛋白质峰做定性分析,无法确定各个蛋白质峰所对应的蛋白质。在后期工作中需要结合其他方法,如CE与质谱的联用等,进一步定性;同时,还要加大检测的样本数量,以获得更有统计学意义的结果。

本文应用CE-LED-IF,对正常人与肝硬化患者血清蛋白质含量的差异性进行了分析,通过考察一系列的影响因素,确定了最优化的电泳条件。在此条件下,CE-LED-IF检测具有良好的重复性。对20例正常人血清及20例肝硬化患者血清进行CE-LED-IF检测,结果显示,肝硬化患者的血清蛋白质中比正常人的多检测到2个蛋白质峰,可能是和肝硬化发生相关的特异蛋白质;肝硬化患者与正常人的血清蛋白质的差异有统计学意义。该方法能实现人血清蛋白质的分离,可为临床诊断肝硬化做参考。