乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)是一种螯合剂,结构如图 1。它与钙离子形成的复合物比与镁离子形成的复合物稳定 100 000 倍,医学上常用来获得无钙环境[1, 2]。EGTA通过螯合作为辅助因子的钙离子可以抑制一些酶(如核酸酶[3])的活性,因此在蛋白质类药品生产中添加EGTA可以抑制蛋白酶对药品的降解,还能够防止金属离子对药物自身氧化的催化,有利于提髙药物在制备、存储和临床配制过程中的稳定性[4]。过量的EGTA能够螯合血液中的Ca2+,造成血液中的钙流失[5, 6],同时会螯合中枢神经细胞外Ca2+,降低下丘脑细胞Ca2+,造成体温升高[7],因此,在药品生产中必须严格控制EGTA的含量。EGTA残留检测的方法还没有报道,但通过EGTA滴定测定一些物质中钙的含量已有研究,如建材[8]、萤石[9]和合金[10]等。滴定法的精确度及灵敏度难以满足药品中微量EGTA的检测,紫外-可见分光光度法可以定性定量地分析EGTA,但难以排除药品中其他成分的干扰,同时也难以达到较高的灵敏度。高效液相色谱(HPLC)具有高压、高速、高效和高灵敏度等优点,在食品安全检测[11]及药品残留[12]中应用较广。EGTA与EDTA同属螯合剂,利用HPLC检测药品中的EDTA含量早有报道[13],因此本文采用HPLC,选择适当的色谱条件检测药品中EGTA的含量。
DAD230+二极管阵列检测器,P230高压恒流泵,EC2000工作站有限公司(以上均购自大连依利特公司)。 BT224S/BT25S电子天平(赛多利斯公司),超声清洗器(深圳洁盟公司),pH计(上海雷磁公司)。
EGTA(Amresco,超级纯,纯度99.1% ,干燥失重0.6% ),乙腈为色谱纯(美国TEDIA),十二水磷酸氢二钠、醋酸钠、醋酸、硫酸铜、10%四丁基氢氧化铵水溶液均为国产分析纯,水为娃哈哈纯净水。
药品由实验室生产,为蛋白质类活性物质,在药品生产中添加EGTA保护药品的活性。4批药品批号分别为S20140507,S20140509,S20140607,S20140609。
空白溶液:精密量取0.01 mol/L 硫酸铜溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,用0.06 mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至刻度,摇匀,过滤。
EGTA标准储备液(500 mg/L):精密称取12.69 mg EGTA,置于25 mL容量瓶中,用0.06 mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至刻度,摇匀。
EGTA对照品溶液:精密量取EGTA标准储备液1 mL,置于10 mL容量瓶中,加入0.01 mol/L 硫酸铜溶液1 mL,用0.06 mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液。
样品溶液:精密称取样品100.00 mg,置于10 mL容量瓶中,加入0.01 mol/L 硫酸铜溶液1 mL,用0.06 mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液。
EGTA对照品与样品混合液:精密称取样品100.00 mg,置于10 mL容量瓶中,加入EGTA标准储备液1 mL和0.01 mol/L 硫酸铜溶液1 mL,用0.06 mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液。
色谱柱:Ultimate-AQ C18 (250 mm×4.6 mm,5 μ m);流动相:乙腈-四丁基氢氧化铵水溶液(质量分数约0.3%四丁基氢氧化铵水溶液,醋酸调pH 6.50)-醋酸钠溶液(35 mmoL/L醋酸钠,醋酸调pH 6.50)(20 ∶ 20 ∶ 60,v/v/v);检测波长:245 nm;流速:1.50 mL/min;柱温:40 ℃;进样量:100 μ L。
取EGTA标准储备溶液配制不同浓度的EGTA对照溶液。量取空白溶液和对照溶液各3 mL,在400～200 nm下进行光谱扫描,结果在240.8 nm处有最大吸收(见图 2)。为了提高方法的稳定性,实验采用检测波长为245 nm。
试验通过检测EGTA与Cu2+的配合物EGTA-Cu来检测EGTA。采用甲醇-水或乙腈-水都难以达到需要的分离效果。考虑用缓冲盐替代水,同时在流动相中添加离子对试剂四丁基氢氧化铵水溶液来调整EGTA-Cu的峰形,最终确定了1.3节的流动相条件。在此条件下,EGTA-Cu出峰时间在5 min左右,与其他杂峰分离较好。精密量取空白溶液、对照品溶液、样品溶液及对照品与样品混合液各100 μ L,分别注入色谱仪,记录色谱图。结果表明,主峰的理论塔板数为 18 000 左右,拖尾因子在1.0左右。样品中其他成分不干扰对EGTA的检测,分离度好,通过二极管阵列检测器检测峰的纯度大于99% 。因此,该流动相条件能够满足EGTA残留检测的要求,结果见图 3。
EGTA在碱性环境中才能溶解,试验中选择用磷酸氢二钠溶液溶解EGTA对照品及样品。由于铜离子在碱性环境中会产生絮状物,因此在对照品溶液和样品配制过程中应先让铜离子与EGTA配合,再用磷酸氢二钠溶液定容。为确保足够铜离子量与EGTA完全配合,本研究按硫酸铜溶液(0.01 moL/L)与EGTA标准储备液(500 mg/L)的体积比为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2配制5份对照溶液,依次进样。结果发现在5种不同铜离子量下测得峰面积的RSD为0.64% ,因此认为铜离子量在这些范围内均能保证与EGTA完全配合,同时表明过量的铜离子对检测没有影响。本研究最终选择硫酸铜溶液(0.01 moL/L)与EGTA标准储备液(500 mg/L)的体积比为1 ∶ 1。
将空白溶剂和样品经高温、强光、强酸、强碱、氧化和水浴等条件破坏,依次进样。结果表明,经高温、强光、强酸、强碱、氧化、水浴条件破坏后,降解产物与主峰能够较好分离,说明药品中其他成分对EGTA的检测没有干扰。
精密量取EGTA标准储备液,配制成质量浓度分别为0.10、0.17、1.00、2.00、5.00、10.00、15.00 mg/L 的对照品溶液,依次进样。以EGTA的质量浓度为横坐标(X,mg/L),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线。EGTA的线性范围为0.10～15.00 mg/L,线性方程为Y=16 490X+1 006.1,R为 0.999 8,满足试验要求。
取EGTA对照品溶液,用0.06 mol/L 磷酸氢二钠逐级稀释,进样并记录色谱图,以信噪比(S/N)为3及10分别确定EGTA的检出限与定量限[14]。结果表明,EGTA的检出限是0.05 mg/L,定量限是0.17 mg/L。
取同一份对照品溶液于室温下放置0、2、4、6、8 h后进样,比较峰面积的变化情况。结果表明，8 h内的RSD为2.50% ,说明对照品溶液在8 h内稳定。
配制6份对照品溶液,在选定的色谱条件下进样,记录色谱图。结果表明6份对照品溶液的峰面积RSD为0.90% ,表明重复性较好。
精密称量100 mg样品,置于10 mL容量瓶中(共称取9份,分成3组)。每组分别精密量取适量的EGTA对照品配制高、中、低3个浓度的对照溶液进行加标回收率试验,结果见表 1。高、中、低3个浓度的平均回收率(n=3)分别为99.03% 、98.34%和98.37% ,表明本色谱条件的准确性良好,能满足药品中EGTA含量的检测。
在选定的色谱条件下检测4批药品中EGTA的含量,每批次药品平行测定两次,结果均未检测出。在检出限为0.05 mg/L,药品浓度为10 g/L 下未检测出EGTA含量,说明药品中EGTA含量低于5 mg/kg。EGTA在药品中的用量标准并未规定,但可以参照EDTA的用量标准来衡量。在药用辅料手册中规定药物剂型中EDTA用作螯合剂的一般含量为0.005% ~0.1%(w/v)[15],GB 2760-2011规定允许EDTA添加于果酱、蔬菜罐头和复合调味料等多种食品中,其最大使用量分别为0. 07、0. 25和0. 075 g/kg[16]。EDTA在药品及食品中的最大用量均大于本文的检出限5 mg/kg,说明药品中EGTA的含量符合要求,本方法满足该药品中EGTA含量的检测。
本文建立了一种高效液相色谱测定药品中EGTA含量的方法,并通过方法学考察证实了该方法的可靠性。在优化的色谱条件下测得药品中 EGTA的含量低于5 mg/kg,参照EDTA限量标准,证实该药品中EGTA含量符合要求。该方法操作简便,具有分离度好、灵敏度高、重复性好、回收率高等优点,其定量限、检出限、重复性及回收率等指标也符合国家药典要求,能够满足药品中EGTA含量的检测,为EGTA检测提供了一种有效的检测方法。
2015, Vol. 33 Issue (4): 419-422
PDF (813 KB)
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