色谱  2015, Vol. 33 Issue (3): 250-255   PDF (948 KB)    
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杨华梅
杭莉
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中4种常用香精
杨华梅 , 杭莉    
泰州市疾病预防控制中心, 江苏 泰州 225300
收稿日期：2014-11-13
通讯作者：杨华梅,Tel:(0523)86393133,E-mail:yanghuamei263@sina.com
摘要：建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中香兰素、乙基香兰素、麦芽酚和乙基麦芽酚4种香精的方法。样品用水提取,固相萃取小柱净化,目标化合物采用UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分离,以甲醇和含0.002 mol/L乙酸铵及0.1%(v/v)甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾离子源电离、正离子多反应监测模式质谱检测。4种香精在5~500 μg/L或10~1000 μg/L质量浓度范围内线性良好,相关系数均在0.9995~0.9998之间;回收率为75.8%~116%,相对标准偏差(RSD, n=6)为1.58%~4.01%。该方法灵敏、准确,检测范围广,分析速度快,适合食品中香兰素、乙基香兰素、麦芽酚和乙基麦芽酚4种香精的检测。
关键词： 超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱法     香兰素     乙基香兰素     麦芽酚     乙基麦芽酚     食品    
Determination of four frequently-used essences in foods by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
YANG Huamei , HANG Li    
Taizhou Center for Disease Control and Prevention, Taizhou 225300, China
Received: 2014-11-13
Abstract: A method has been developed for the simultaneous determination of vanillin, ethyl vanillin, maltol and ethyl maltol in foods by ultra performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS). The sample was extracted with ultrapure water, and purified with SPE column. The target compounds were separated on a C18 column with the gradient elution of methanol and water containing 0.002 mol/L ammonium acetate and 0.1%(v/v) formic acid. The four components were determined in the modes of electrospray positive ionization (ESI+) and multiple reaction monitoring (MRM). The linear ranges were 10-1000 μg/L for vanillin and maltol and 5-500 μg/L for ethyl vanillin and ethyl maltol, with the correlation coefficients more than 0.999. The recoveries of the four compounds ranged from 75.8% to 116%, with the relative standard deviations (RSDs) of 1.58%-4.01%. The method showed good extraction efficiency, high sensitivity and good reproducibility. It is suitable for the simultaneous detection of vanillin, ethyl vanillin, maltol and ethyl maltol in foods.
Key words: ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS)     vanillin     ethyl vanillin     maltol     ethyl vanillin     food    

香精作为一种可影响食品口感和风味的特殊高倍浓缩添加剂已经被广泛应用到食品生产的各个领域,它可以弥补食品本身的香味缺陷,赋予部分食品生动的原滋味,加强食品的香味,掩盖食物的不良气息[1, 2]。香兰素、乙基香兰素、麦芽酚和乙基麦芽酚是食品中常用的重要的食品增香剂,它们被广泛用作糖果、饼干、糕点和饮料中。但美国儿童科学年报报道过量摄入食用香精、香料会加重肾的负担,有损脏器的发育[3];欧盟专家委员会报道,大剂量食用香兰素可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难,甚至损伤肝、肾;而麦芽酚具有弱的致突变活性和诱导细胞死亡的毒性作用[4],并且它可以控制人体内铁和铝的含量水平[5, 6]。而我国不少商家为了追求最大利益违法添加香料,以至出现“香精大米”和“香精包子”等事件。目前GB2760-2011《食品安全国家标准食品添加使用标准》中规定较大婴儿和幼儿配方食品中香兰素和乙基香兰素的最大使用量均为5 mg/100 mL,婴幼儿谷类辅助食品中香兰素的最大使用量为7 mg/100 mL,0至6个月婴幼儿配方食品以及巴氏杀菌乳等14类新鲜原味食品中不得添加任何食用香料。考虑到大量食用这些人工合成的香精会对人体造成潜在性危害以及缺少相应的检测标准,建立食品中香精的检测方法具有重要的意义。

目前文献报道单独检测香兰素、乙基香兰素、麦芽酚、乙基麦芽酚的方法很多,有光度法[7]、伏安法[8]、电极法[9]、高效液相色谱法(HPLC)[10, 11, 12, 13, 14, 15]、化学发光法[16]、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法[17]、液相色谱-质谱联用法[18, 19]以及毛细管电泳法[20]等。同时测定这4种物质的方法只搜索到两篇文献报道,一是任呼博等[21]用HPLC同时测定了烟用添加剂中的这4种物质;二是Ni等[22]用分光光度法同时测定了食品中的这4种香精。本文采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-MS/MS)对食品中的香兰素、乙基香兰素、麦芽酚和乙基麦芽酚4种香精进行了同时测定。

1 实验部分
1.1 仪器与设备

Waters ACQUITY超高效液相色谱;AB SCIEX API4000+质谱仪;中佳HC-3018R高速冷冻离心机。

1.2 试剂与材料

甲醇(色谱纯,德国Merck公司);实验用水:屈臣氏瓶装蒸馏水;乙酸铵和甲酸(色谱纯,美国Tedia公司); STYRE-SCREENRSSH2P固相萃取小柱(60 mg/3 mL,美国UCT公司);香兰素(纯度98% )、乙基香兰素(纯度99% )、麦芽酚(纯度99% )和乙基麦芽酚(纯度99% )。试验中牛奶、火腿、瓜子、大米、饮料和糕点等30份样品均购自本地超市。

1.3 标准溶液的配制

分别称取香兰素、乙基香兰素、麦芽酚、乙基麦芽酚0.1 g(精确至0.1 mg),置于10 mL量瓶中,加少量甲醇溶解后,用纯水稀释至刻度,置于冰箱中冷藏。临用前用纯水配制成质量浓度均为10 mg/L 的4种物质的混合标准溶液。

1.4 样品前处理

液体样品:准确称取样品1.0 g至50 mL离心管中,加入10 mL水稀释混匀,备用;半固体样品和固体样品:准确称取样品1.0 g于50 mL离心管中,加入10 mL水,置于摇床振摇(300 r/min) 30 min后,冷冻离心(5 ℃,10 000 r/min) 5 min,取上清液5 mL上柱;油脂及果胶类样品:准确称取样品1.0 g于50 mL离心管中,加入10 mL水,置于摇床振摇(300 r/min) 30 min后,冷冻离心(5 ℃,10 000 r/min) 5 min,上层水溶液全部用定性滤纸过滤,取滤液5 mL上柱。

将SSH2P固相萃取小柱分别用3 mL甲醇、3 mL水活化。将上述离心后的样品加入小柱内,常压过滤,待样液全部上完后用20 mL水洗涤小柱并真空抽近干,用1 mL甲醇洗脱待测物,最后用含0.002 mol/L 乙酸铵和0.1%(v/v)甲酸的水溶液将洗脱液定容至5 mL,混匀后进行仪器分析。

1.5 LC-MS/MS条件
1.5.1 LC条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m);流速:0.2 mL/min;进样体积:10.0 μ L;柱温:30 ℃;样品室温度:25 ℃;流动相:A为0.002 mol/L 乙酸铵和0.1%(v/v)甲酸的水溶液;B为甲醇;梯度洗脱程序:0～6 min,2%B～98%B; 6～7 min,98%B; 7～9 min,98%B～2%B; 9～10 min,2%B。

1.5.2 MS/MS条件

扫描方式:电喷雾电离源正离子(ESI+)扫描;采集模式:多反应监测(MRM)模式;碰撞气压力(CAD): 6 Pa;气帘气压力(CUR): 15 Pa;雾化气压力(GS1): 50 Pa;辅助气压力(GS2): 50 Pa;入口电压(EP): 10 V;碰撞室出口电压(CXP): 12 V;喷雾电压:5 500 V;气化温度:300 ℃。定量和定性离子、碰撞能量等参数见表1。

表1 4种物质的保留时间、相对分子质量和串联质谱分析参数 Table 1 Retention times,relative molecular masses and MS/MS parameters for the four compounds
2 结果与讨论
2.1 液相色谱条件的优化

选用Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱,以甲醇和水为流动相,在水中加入0.002 mol/L 乙酸铵和0.1%(v/v)甲酸有助于待测物的母离子[M+H]+的形成,并能增强检测的灵敏度。在1.5.1节条件下，各个待测物的离子流图见图1。

图1 4种标准物质的总离子流图 Fig.1 Total ion current chromatograms of the four standards
2.2 质谱条件的优化
2.2.1 定性、定量离子的选择

根据4种香精的结构特征,选择正离子模式电离,采用流动注射泵进样,分别对质量浓度为1.0 mg/L 的4种香精标准溶液进行一级质谱扫描,确定其准分子离子峰,并分别优化其去簇电压。分别以其准分子离子为母离子,通过碰撞气碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描,同时优化碰撞电压,选择丰度较高的2种碎片离子作为定性与定量特征离子。通过试验优化,4种香精的定性与定量特征离子及优化的质谱参数见表1。

2.2.2 分析物的子离子产生途径

从香兰素的化学结构式可以看出其苯环上有羟基、甲氧基和醛基3个基团,图2中香兰素的碎裂途径表明,流动相中游离氢离子易进攻稳定性最差的醛基形成m/z 153.2母离子,当碰撞电压小时母离子脱去一个CO分子形成m/z 125.4子离子,当碰撞电压大时母离子同时脱去一个CO分子和一个CH3OH分子形成m/z 93.1子离子;图2中乙基香兰素的裂解原理同香兰素。

图2 4种化合物可能的碎裂途径 Fig.2 Tentative fragmentation pathways for the four compounds

从麦芽酚的化学结构式可以看出其吡喃酮环上有一个甲基和一个羟基,图2中麦芽酚的碎裂途径表明,流动相中游离氢离子易进攻羟基形成m/z 127.1母离子,当碰撞电压小时母离子脱去一个水分子形成m/z 109.2子离子,当碰撞电压增大时电子在环内传递吡喃酮环发生裂解并结构重组,形成m/z 52.9子离子;而图2中乙基麦芽酚则是在电压小时母离子脱去一个甲基正离子形成m/z 126.1分子,电压增大时母离子也发生环裂解并结构重组形成m/z 70.9子离子。

2.3 样品前处理条件的选择

食品中蛋白质的含量较高,用水对样品进行浸泡处理时会带入大量的水溶性蛋白质,因此测定前需对样品进行净化处理。

本文采用固相萃取法对提取液进行净化,试验中选用不含4种化合物的牛奶样品,添加10 mg/L 的混合标准溶液0.5 mL,对比了STYRE-SCREENRSSH2P小柱(60 mg/3 mL)和CNWBOND LC-C18小柱(500 mg/6 mL)的富集、净化效果,结果见表2。

表2 采用2种固相萃取小柱净化时4种物质的回收率 Table 2 Recoveries of the four compounds purified with two SPE cartridges

通过试验比较,发现上样后C18小柱对麦芽酚和乙基麦芽酚不保留,而SSH2P小柱对4种物质富集都很好。原因在于麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素和乙基香兰素均具有弱酸性,尤其是麦芽酚和乙基麦芽酚的极性较大,普通的C18柱不适合极性较大的物质,而SSH2P小柱填料为苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒,对酸性、中性和碱性化合物均能较好地富集。试验证明SSH2P小柱既对4种物质有着很好的富集回收率,又能去除大量水溶性蛋白质,因此本试验选择STYRE-SCREENRSSH2P小柱进行净化。

2.4 定量限及线性关系

将10 mg/L 的混合标准溶液用甲醇和0.002 mol/L 乙酸铵及0.1%(v/v)甲酸水溶液(体积比1 ∶ 4)配制成系列浓度的标准溶液,仪器检出限为样品处理后的阴性基质中添加标准品的方式获得(S/N≥3),定量限采用在样品处理后的阴性基质中添加标准品的方式获得(S/N≥10);以目标组分定量离子的响应值y对相应的质量浓度x ( μ g/L)绘制标准曲线,4种香精的质量浓度线性关系良好,相关系数r在 0.999 5～0.999 8 之间(见表3),均满足检测要求。

表3 线性关系、相关系数(r)、仪器检出限(IDL)和定量限(LOQ) Table 3 Linear relationships,correlation coefficients (r),limits of instrument detection (IDLs) and quantification (LOQs)
2.5 回收率、精密度和基质效应

在牛奶、火腿、瓜子、大米、果冻及糕点阴性样品中分别添加0.50 mg/kg 的混合标准溶液,混合后静置,使标准溶液被样品充分吸收,然后按照本方法测定,计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。另外将牛奶、火腿、瓜子、大米、果冻及糕点阴性样品按优化的方法制成基质溶液并用其稀释标准溶液后测定,计算每种样品的基质效应。

由表4数据可以看出，4种香精的回收率为75.8% ～116% ,RSD为1.58% ～4.01% ,基质效应为2.37% ～37.8%,表明净化效果和质谱条件较为合理,有利于定量分析的准确性。

2.6 实际样品的检测

利用本文建立的分析方法,对火腿肠、瓜子、牛奶、饮料、大米以及糕点等6类30份样品中的4种香精进行了测定,结果见表5。可以看出，香兰素的检出含量为0.082～53 mg/kg,乙基香兰素的检出含量为0.10～6.8 mg/kg,麦芽酚的检出含量为0.17～3.7 mg/kg,乙基麦芽酚的检出含量为0.12～6.6 mg/kg。

表4 各种基质中4种物质的加标回收率、RSD和基质效应(n=6) Table 4 Recoveries,RSDs and matrix effects of the four compounds spiked in different matrices (n=6)

表5 实际样品中4种化合物含量的分析结果 Table 5 Analytical results of the four compounds in practical samples
3 结语

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法用于同时测定食品中香兰素、乙基香兰素、麦芽酚和乙基麦芽酚4种香精。此方法灵敏度高、选择性好、前处理方法简单,线性关系、回收率和重现性等方法学指标较好,特别是分析时间短,仅用时10 min即完成,为食品中香兰素、乙基香兰素、麦芽酚和乙基麦芽酚4种香精的快速检测提供了一种可靠的方法。

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